無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測胎兒染色體非整倍體技術研究及應用進展

張磊 王威

（深圳華大基因研究院，廣東 深圳 518083）

1 背景介紹

中國是出生缺陷高發(fā)國家，根據(jù)全國出生缺陷醫(yī)院監(jiān)測數(shù)據(jù)（監(jiān)測期限為妊娠滿28周至產(chǎn)后7天）顯示，出生缺陷發(fā)生率呈上升趨勢，由1996年的87．7萬上升到2010年的149．9萬，增長幅度達70．9%［1］，染色體異常是導致出生缺陷的重要原因。據(jù)統(tǒng)計，約160例新生兒中就有1例是染色體異常患者［2］。在眾多染色體異常疾病中，染色體非整倍體導致的殘疾及生活障礙尤為明顯，其中又以21－三體綜合征最為常見，在新生兒中發(fā)病率為1／800，且隨著母親年齡的增長有顯著上升趨勢［2］。目前中國已經(jīng)有60萬以上的21－三體綜合征患者，其數(shù)目仍以每年26 600例的速度在增長。2003數(shù)據(jù)顯示，我國每1例新發(fā)21－三體綜合征患兒將給社會造成45萬元左右的經(jīng)濟負擔，所有新發(fā)病例的經(jīng)濟損失達81．4億元［3］。降低染色體非整倍體胎兒的出生率、提高平均人口質量已經(jīng)成為當前備受關注的社會問題和亟待解決的醫(yī)學問題。

目前，對于染色體非整體的檢測主要是基于血清學和超聲診斷學檢查的無創(chuàng)產(chǎn)前篩查和有創(chuàng)取樣的產(chǎn)前診斷，根據(jù)檢測結果對胎兒采取選擇性流產(chǎn)的方法，以達到降低出生缺陷發(fā)生率的目的［2］。近些年來，母體外周血中胎兒游離DNA的發(fā)現(xiàn)，為無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測（Noninvasive Prenatal Testing，NIPT）胎兒染色體非整倍體開辟了新的發(fā)展方向。而新一代基因測序技術，特別是大規(guī)模并行測序技術（Massively Parallel Sequencing，MPS，又稱高通量測序技術）的迅猛發(fā)展，為NIPT技術的開發(fā)提供了堅實的技術保障［4］。國內外眾多知名科研機構和企業(yè)紛紛開展基于高通量測序的NIPT檢測胎兒染色體非整倍體的研究并嘗試臨床應用。國際產(chǎn)前診斷學會（International Society for Prenatal Diagnosis，ISPD）特別針對這一快速發(fā)展的新技術在2012年32卷的《Prenatal Diagnosis》上發(fā)布了一篇即時評論，指明了該領域的下一步發(fā)展方向和需要克服的障礙［5］。

2 胎兒游離DNA的特點、NIPT檢測胎兒染色體非整倍體的基本原理及早期實驗研究

1997年在孕婦外周血中發(fā)現(xiàn)有胎兒游離DNA［4］。孕婦外周血游離DNA中約90%～95%來自母體自身凋亡DNA片段，約5%～10%來自胎兒凋亡細胞。相比母體外周血中的其他胎兒成分，如胎兒游離RNA以及胎兒有核紅細胞，胎兒游離DNA含量相對高，提取及分析過程簡單，易于發(fā)展為可應用于臨床的大樣本高通量的檢測方法。另外，胎兒游離DNA在孕早期就可檢測到，其含量隨著孕周的增加而增加，分娩后2小時即被清除，不會對下一次妊娠產(chǎn)生影響［4，6］?；谔河坞xDNA的以上特點，應用高通量測序技術對孕婦外周血總的游離DNA（包含胎兒游離DNA）進行測序、分析有可能檢測出胎兒染色體畸變。該技術不依賴特定目標區(qū)域、不依賴多態(tài)性位點，對所取的母體外周血樣本中所有游離的DNA進行高通量測序，并基于生物統(tǒng)計學將測序結果進行信息分析，根據(jù)分析結果判斷胎兒患染色體非整倍性疾病的風險。2008年Fan等［7］首次對18例樣本進行高通量測序、分析，準確檢測出9例21－三體（T21）、2例18－三體（T18）、1例13－三體（T13）和6例染色體整倍體。2個月后Chiu等［8］在同一期刊上發(fā)表文章，他們的研究顯示：14例T21和14例整倍體胎兒均通過孕婦外周血游離DNA高通量測序的方法準確檢測出。因此，對孕婦外周血中游離DNA進行高通量測序可用于無創(chuàng)性產(chǎn)前基因檢測，滿足對胎兒染色體非整倍體疾病早期診斷與預防的要求。

3 技術現(xiàn)狀

3．1 T21、T18和T13檢測情況 T21、T18和T13的發(fā)病率分別1／800、1／6000和1／10 000，是目前臨床上較常見的染色體疾?。?］。2011年至今，全球多個中心針對這3種染色體疾病開展了大樣本臨床研究（樣本量范圍108～4664例）。研究結果顯示基于高通量測序的NIPT技術能夠準確檢測T21、T18和T13等相對常見的染色體非整倍體［9－15］。綜合分析表明：T21、T18和T13檢測的準確率分別達到99．4%、97．4%和92．5%，而假陽性率則分別為0．2%、0．5%和0．8%（表1）。在不同的研究中心，由于各種因素導致的檢測失敗率各不相同，波動于0～3．8%（表2）。影響檢測結果準確性和成功率的主要因素是孕婦外周血中胎兒游離DNA濃度。如果胎兒游離DNA濃度低于3%，檢測結果的準確性將受到影響［11，14］。目前初步研究顯示，胎兒游離DNA濃度有隨孕周增加而增加的趨勢，同時還受到其他因素影響，如胎兒染色體異常、孕婦體重指數(shù)等。懷有染色體異常胎兒的孕婦其外周血胎兒游離DNA較懷有正常胎兒的孕婦外周血胎兒游離DNA濃度高；而孕婦體重指數(shù)越大，由于血量增大導致的稀釋作用，外周血中胎兒游離DNA濃度越低［6，11］。胎兒游離DNA濃度與上述因素的確切關系還需要更大樣本的驗證。

3．2 其他染色體數(shù)目異常、嵌合體、微缺失微重復 除T21、T18和T13，NIPT技術理論上還可以檢測包括性染色體在內的其他染色體非整倍體，有報道的性染色體相關疾病包括XO、XXY、XXX、XYY等。對于胎兒性別的判斷目前該技術的準確性可以達到99%以上［9，13，15］。由于我國法律禁止非醫(yī)學目的的胎兒性別鑒定，因此該技術是否能夠用于胎兒性別鑒定及如何應用還需要有指導性文件進行規(guī)范。其他罕見染色體數(shù)目異常（如16三體、20三體）、嵌合體、易位型和微缺失微重復也有報道，且胎兒某條染色體存在異常不影響對其他染色體的分析［13，16，17］。由于目前報道的21、18和13號以外的染色體非整倍體、嵌合體和微缺失微重復的病例數(shù)目還較少，同時部分病例缺乏后續(xù)跟蹤和驗證。因此，針對少見染色體異常病例的臨床研究還需要進一步完善。

表1 NIPT檢測21－三體、18－三體和13－三體綜合征靈敏度及假陽性率

表2 主要國際文獻匯總

3．3 輔助生殖（IVF）受孕病例 ISPD針對該技術發(fā)表的即時評論中提出，在NIPT應用于T21的臨床檢測前，在IVF病例中還需要有更多的數(shù)據(jù)進行支撐。Bianchi等［13］的研究顯示，在IVF受孕的38名中，NIPT發(fā)現(xiàn)17例染色體異常，與核型分析對比，沒有發(fā)現(xiàn)假陽性或假陰性結果。該研究初步表明，NIPT在輔助生殖病例中同樣是準確的。由于目前進行IVF的夫婦有一部分是由于夫婦本人自身遺傳背景存在缺陷，所以目前還缺乏來自多個中心的更大樣本的真實臨床環(huán)境的數(shù)據(jù)進行支持。

3．4 雙（多）胎 目前幾乎所有的NIPT臨床研究都是針對單胎，針對雙（多）胎病例進行NIPT的研究非常少。NIPT檢測雙（多）胎染色體非整體的技術難點為：①雙（多）胎有同卵與異卵之分，同卵雙（多）胎遺傳背景相對單一，理論上可以進行檢測；②對于異卵雙（多）胎，由于對孕婦外周血全部游離DNA（孕婦＋胎兒）進行測序分析，無法區(qū)分異常的染色體屬于雙（多）胎中的哪一個或者全部；（3）雙（多）胎孕婦外周血中胎兒游離DNA濃度與單胎也有差異，需要對試驗條件進行摸索。Sehnert等［18］成功準確檢測4例雙胎樣本，其中1例為47，XY，＋21核型的同卵雙胎；另1例為異卵雙胎，2個胎兒之一為T21，另一胎兒核型正常；剩余2例雙胎核型正常。Canick等［19］對25例雙胎（17例整倍體，5例同卵T21、2例異卵T21、1例異卵T13）和2例三胎病例（均為整倍體）進行分析，檢出率100%，假陽性率0。雖然目前的研究在雙（多）胎病例中顯示出極高的檢出率和極低的假陽性率，但考慮到雙（多）胎病例臨床情況的復雜性，尚需要有更多的證據(jù)進行驗證。

3．5 孕婦及醫(yī)護人員對NIPT態(tài)度 由于NIPT具有安全、準確、早期、快速等特點，所以該技術一經(jīng)應用到臨床即得到了廣大孕婦的一致認可。Lau等［20］的研究顯示，NIPT能夠使95%的孕婦的焦慮情緒得到緩解，95%以上的孕婦會將該檢測推薦給其他人。并且，60%以上的孕婦會推薦他們的朋友選擇NIPT作為一線篩查方法，35%以上的孕婦會推薦他們的朋友選擇NIPT作為二線篩查方法。Yotsumoto等［21］在252名日本民眾和醫(yī)護人員中進行的問卷調查顯示，日本民眾普遍對該技術持積極肯定態(tài)度，醫(yī)護人員則特別強調在接受檢測前和檢測后咨詢的重要性。

4 臨床定位

目前基于血清生化的篩查技術仍然是被絕大部分醫(yī)院和產(chǎn)前診斷中心所采用的一線篩查方法，而CVS、羊水穿刺或者臍血穿刺等侵入性操作的核型分析技術仍是染色體非整倍體診斷的金標準。2010年6月，由我國衛(wèi)生部醫(yī)療服務標準專業(yè)委員會提出、經(jīng)衛(wèi)生部批準實施的《胎兒常見染色體異常與開放性神經(jīng)管缺陷的產(chǎn)前篩查與診斷技術標準》對中孕期血清學產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷工作流程進行了詳細的說明（圖1）［22］。隨著NIPT技術的出現(xiàn)和臨床研究的不斷完善，目前NIPT技術被傾向于定位為T21、T18和T13等常見染色體非整倍體疾病的二線篩查手段。受檢者需要在給予充分咨詢、知情同意的情況下自愿選擇參加NIPT［5］。結合我國臨床實際情況，NIPT技術與常規(guī)臨床產(chǎn)前篩查與診斷流程可以非常好的進行整合（圖2）?，F(xiàn)有的研究認為，在常規(guī)唐氏篩查高危的孕婦中進行NIPT可以大大減少需要進行侵入性診斷操作患者數(shù)目，從而有效減少由于侵入性操作而帶來的流產(chǎn)和宮內感染等不良影響，同時可以緩解絕大部分孕婦的焦慮［11，13，20］。對于常規(guī)唐氏篩查低危的孕婦，ISPD 認為在孕婦知情同意的情況下可以自主選擇是否將NIPT作為首選產(chǎn)前篩查方法［5］。從目前產(chǎn)前篩查技術的發(fā)展情況來看，安全、準確、早期的基因篩查技術是未來的發(fā)展趨勢，而且這一發(fā)展趨勢也得到了國內外該領域專家的一致認同。

5 問題與挑戰(zhàn)

ISPD發(fā)表的即時評論在關注該技術廣闊臨床應用前景的同時，也提出在以下方面還需要更多的數(shù)據(jù)來證實該技術也行之有效，包括：①在低危人群中的檢測效果；②能否適用于雙胎和輔助生殖受孕的胎兒的檢測；③是否符合衛(wèi)生經(jīng)濟學的要求；④如何與其他篩查方法聯(lián)合應用得出風險評估結果。同時，ISPD還提出需要進行檢測前告知，告知的內容包括：①檢測的范圍僅占染色體異常的一半（美國僅檢測T21，據(jù)文獻報道，在中孕期羊水穿刺所發(fā)現(xiàn)的各種染色體異常中，T21約占50%～55%，T21、T18和T13所占比例之和約60%～65%［23，24］）；②假陰性結果可能；③假陽性結果可能；④陽性結果者需接受有創(chuàng)性檢測（絨毛活檢或羊膜腔穿刺），該過程可能產(chǎn)生的焦慮情緒；⑤檢測失敗的可能（因取材等原因）；⑥對于單基因病、微缺失綜合征高危的孕婦建議直接行有創(chuàng)性檢測。

圖1 中孕期孕婦血清學產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷工作流程圖

6 未來發(fā)展方向

6．1 測序技術的飛速發(fā)展 1953年人類發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺旋結構，自1984年世界上第一臺自動測序儀問世以來，基因測序技術在最近的30年間迅速發(fā)展，特別是第二代高通量測序技術問世以來，測序費用顯著下降，測一個人的基因組的費用由2001年的1億美元下降到2011年不足1萬美元（圖3）［25］。隨著第三代測序技術的研發(fā)和應用，未來測序儀器的更新速度將越來越快，測序技術將逐漸向小型化、高通量和快速化發(fā)展，這必將為基于基因測序的臨床檢測技術提供更堅實的物質基礎和技術保障。

6．2 現(xiàn)有染色體非整倍體檢測方法和未來發(fā)展方向 目前染色體非整倍體的檢測技術包括基于SNP多態(tài)性的QPCR檢測、基于甲基化位點的QPCR檢測、基于SNP多態(tài)性的飛行時間質譜、基于甲基化位點的飛行時間質譜、目標區(qū)域測序和全基因組測序，這些技術各有特點（表3）。目前檢測效果最好、研究最多的是基于全基因組測序的NIPT技術。該技術還擁有良好的可擴展性，除染色體非整倍體外將來還可能應用于胎兒微缺失微重復、單基因病、甚至全基因組的檢測［26，27］。隨著全基因組測序技術的不斷進步和測序費用的不斷下降，將來基于全基因組測序的檢測技術將擁有非常廣闊的發(fā)展空間，將向更加快速化、早期化和個性化邁進。

圖2 整合NIPT技術的中孕期孕婦血清學產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷工作流程圖

7 衛(wèi)生經(jīng)濟學分析

Chen等［12］的研究顯示，該研究組所開發(fā)方法每例樣本的測序試劑和人工成本大約1000美元。Palomaki等針對美國的情況進行了衛(wèi)生經(jīng)濟學分析，假設10萬名唐氏高危孕婦需要進行侵入性產(chǎn)前診斷，每例侵入性產(chǎn)前診斷花費1000美元，共需花費1億美元。目前的數(shù)據(jù)表明，真實的懷有T21胎兒的病例占所有進行有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷病例的3%，侵入性診斷有0．5%的幾率引起流產(chǎn)或宮內感染而導致胎兒丟失。因此，10萬例接受侵入性產(chǎn)前診斷的孕婦可檢出3000例T21，并引起侵入性操作相關的胎兒丟失500例。如果10萬名唐氏高危孕婦先進行NIPT，檢測結果陽性的病例再通過侵入性診斷程序進行確診，將檢出2958例T21（42例漏檢），引起操作相關的胎兒丟失20例，共花費390萬美元。2種不同策略所需要投入的資金之間的差額為9610萬美元，完全可以覆蓋進行NIPT所需的費用。而且，由于新技術的應用所挽救的480名胎兒的生命，其價值無法用貨幣來衡量［11］。

圖3 基因測序技術的發(fā)展歷程及基因組測序費用變化趨勢

由于我國不同中心所采用的唐氏綜合征血清學篩查標準有所差異，所檢出的高危孕婦對羊水穿刺等有創(chuàng)診斷方法的接受程度也有很大不同，因此很難給出全國性的參考值。本文以徐聚春等［28］在當?shù)刂行倪M行的大樣本唐氏綜合征篩查研究結果為例，分別對引入NIPT前后整個社會的經(jīng)濟投入進行綜合分析。結果顯示，采用傳統(tǒng)血清學篩查、高危孕婦進行有創(chuàng)診斷的方案，8864名孕婦共計支出246萬元（唐氏綜合征血清學篩查106萬元＋羊水穿刺、核型分析50萬元＋2例漏檢病人90萬元），可能導致約2例胎兒丟失（按照0．5%風險率進行計算［29］）并且給430名孕婦帶來焦慮情緒。如果采用整合NIPT技術的新型篩查、診斷模式，8864名孕婦共計支出225．2萬元（唐氏綜合征血清學篩查106萬元＋NIPT檢測73萬元＋羊水穿刺、核型分析1．2萬元＋1例漏檢病人45萬元）。新模式可顯著降低漏檢風險，極大程度上緩解血清學篩查高危孕婦及家人的焦慮情緒并幾乎可避免胎兒丟失，為全社會節(jié)約8．5%的衛(wèi)生支出。而且，隨著中國經(jīng)濟的發(fā)展，目前一名21－三體綜合征患者的花費將遠遠 超 過 45 萬 元 （2003 年 數(shù) 據(jù)）［3］，所 以，整 合NIPT后的新型篩查模式為整個社會節(jié)約的衛(wèi)生資源將更加顯著（圖4）。同時，隨著基因測序技術的不斷進步和費用的不斷下降，NIPT技術應用在衛(wèi)生領域帶來的經(jīng)濟學效益將更加明顯，在未來的3年內NIPT技術將可能成為大部分孕婦首選的染色體非整倍體產(chǎn)前篩查方法。

8 總 結

NIPT技術不需要進行損傷性取樣，只需抽取母體5 ml左右外周血，具有無創(chuàng)傷、準確率高、特異性強等優(yōu)勢，孕12周即可進行，周期相對短。目前主要作為T21、T18和T13染色體非整倍體的篩查方法。適用人群包括所有希望進行T21、T18和T13產(chǎn)前篩查的孕婦；孕婦年齡達35歲或以上的高齡孕婦，拒絕做羊水穿刺者；孕早、中期血清篩查21三體高危者；孕早期超聲提示胎兒異常；有穿刺禁忌證孕婦（胎盤前置、流產(chǎn)征兆、感染乙肝、HIV、TP等）；IVF、習慣性流產(chǎn)及其他原因的“珍貴兒”?，F(xiàn)階段，NIPT作為一項篩查性質的技術，需要受檢者知情同意知情選擇基礎上，在檢測妊娠12周以后都可以進行檢測，最佳檢測孕周為12～24周，并輔以檢測前、后的臨床咨詢。隨著技術的不斷進步，將來這一技術還可能應用于胎兒染色體微缺失微重復、單基因病甚至全基因組的無創(chuàng)基因檢測，從而為我國的出生缺陷防控做出更大的貢獻。

表3 染色體非整倍體檢測方法總結

圖4 8864名孕婦采用不同篩查模式的衛(wèi)生經(jīng)濟學分析

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