熒光原位雜交技術(shù)在羊水染色體數(shù)量分析中的應(yīng)用

錢(qián)源 肖雪 郭知 張?zhí)m 胡大軍 馬潤(rùn)玫

（昆明醫(yī)科大學(xué) 婦產(chǎn)科細(xì)胞遺傳實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650032）

目前較為普遍的染色體疾病檢測(cè)方法是細(xì)胞遺傳學(xué)染色體核型分析，該技術(shù)需要對(duì)處于分裂中期的細(xì)胞進(jìn)行，準(zhǔn)確性高，但需細(xì)胞培養(yǎng)后進(jìn)行染色體制備。FISH技術(shù)是近分子細(xì)胞遺傳學(xué)生物學(xué)方法中的一種，它的檢測(cè)無(wú)需細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)于13、18、21、X，Y染色體數(shù)目異常的檢測(cè)最快可在48小時(shí)內(nèi)完成，并且準(zhǔn)確率高［1－3］。

需要進(jìn)行羊膜腔穿刺的妊娠婦女一般都為產(chǎn)前篩查為高風(fēng)險(xiǎn)或者B超提示胎兒異常等指征，如等待染色體結(jié)果的時(shí)間較長(zhǎng)，則會(huì)給孕婦的情緒帶來(lái)較大的影響。FISH檢測(cè)能在較短的時(shí)間內(nèi)獲得結(jié)果，本研究擬回顧本實(shí)驗(yàn)室自開(kāi)展FISH以來(lái)的檢測(cè)結(jié)果，并與培養(yǎng)的羊水細(xì)胞染色體核型結(jié)果相比較，研究孕婦年齡、產(chǎn)孕次與胎兒異常類(lèi)型的相關(guān)性，以及母血污染對(duì)結(jié)果的判讀的影響。

1 材料與方法

1．1 研究對(duì)象 選擇本院自2011年1月至2012年5月期間進(jìn)行羊膜腔穿刺的妊娠婦女共248名，其中5人為雙胎樣本，其中4例為單絨毛膜性，1例為雙絨毛膜性，故分別抽取A和B胎的羊水，所以羊水總例數(shù)為249。所有羊水均培養(yǎng)成功進(jìn)行核型分析。孕婦年齡21～43歲，孕周為18～24周。

1．2 研究方法

1．2．1 羊水采集 在B超引導(dǎo)下，用21G PTC穿刺針經(jīng)腹壁抽取羊水25ml，置于無(wú)菌注射器中。留取5ml用于FISH檢測(cè)，其余用于細(xì)胞培養(yǎng)。

1．2．2 羊水細(xì)胞FISH 檢測(cè) 步驟包括制片、雜交、洗脫和鏡檢部分。詳細(xì)操作參考金菩嘉公司操作手冊(cè)，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的條件。共使用5種染色體探 針，分 為 2 組，即 13／21 組 和 18／X／Y 組。13／21組的探針?lè)謩e標(biāo)記位于13q14（綠色）和21q22（紅色）處。18／X／Y探針組為CSP探針，探針?lè)謩e定位于18，X，Y 的p11．1－q11．1區(qū)域，分別標(biāo)記水藍(lán)色、綠色和紅色。

1．2．3 結(jié)果判讀 選擇50個(gè)形態(tài)規(guī)整的間期核閱讀雜交信號(hào)。正常信號(hào)方式細(xì)胞的比例達(dá)到90%以上即可定為正常。某種異常信號(hào)方式細(xì)胞的百分比達(dá)到60%以上，則可為異常。如結(jié)果判斷為嵌合體類(lèi)型則選擇100個(gè)形態(tài)規(guī)整的間期核閱讀雜交信號(hào)。

2 結(jié) 果

249例羊水染色體檢測(cè)中，染色體正常數(shù)目的有243例（其中111例XY，132例XX）。共檢出染色體數(shù)目異常6例，異常率為2．4%。異常類(lèi)型包括21三體，13三體，18三體，XO和嵌合型XO，以及XXX（見(jiàn)表1）。21三體有2例，占全部異常的33．3%。所有FISH結(jié)果均與培養(yǎng)后羊水細(xì)胞核型分析結(jié)果相吻合，嵌合體的比例也與之相吻合。有1例雙絨毛膜性雙胎結(jié)果中A胎為18三體，B胎正常。

表1 249例羊水細(xì)胞FISH檢測(cè)結(jié)果以及產(chǎn)前診斷指征（共6例異常）

如果按照母親年齡是否大于35歲為界，將樣本分為2組，≥35歲組和＜35歲組?？偣?例異常樣本中的5例分布于＜35歲組中。僅1例為＞35歲組，具體核型詳細(xì)見(jiàn)表2。

表2 按年齡分組的異常檢測(cè)結(jié)果

按照母親懷孕次數(shù)分為3組，懷孕次數(shù)1次、2次和3次組中分別有3例，1例和2例染色體數(shù)目異常胎兒，詳細(xì)見(jiàn)表3。按照生產(chǎn)次數(shù)分為2組，生產(chǎn)0次與生產(chǎn)1次組中各有3例異常類(lèi)型（表4）。

表3 按孕次分組的異常檢測(cè)結(jié)果

表4 按產(chǎn)次分組的異常檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

產(chǎn)前診斷為侵入性宮內(nèi)診斷，通過(guò)各種檢測(cè)或者技術(shù)手段，對(duì)胎兒的先天性或者遺傳性疾病做出診斷。傳統(tǒng)方法為羊水細(xì)胞培養(yǎng)后的G帶顯色檢測(cè)。該方法的局限性為檢測(cè)周期長(zhǎng)（通常為21天），可能面臨細(xì)胞培養(yǎng)失敗的問(wèn)題。

FISH的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。FISH具有的最明顯優(yōu)點(diǎn)為檢測(cè)速度快，不需細(xì)胞培養(yǎng)，所需羊水量小，與核型吻合率也較高［3－6］。

本研究FISH診斷的結(jié)果與核型分析相一致。249例樣本中共檢出染色體數(shù)目異常6例，21三體在異常類(lèi)型中所占的比例最高?？梢?jiàn)，唐氏綜合征的篩查和診斷是非常重要和必要的。

在本研究所有穿刺指征類(lèi)別中，B超提示胎兒異常組中檢出的異常比例較其他類(lèi)別高，這提示B超對(duì)于胎兒染色體發(fā)生異常的提示作用是不容忽視的。本研究中惟一的1例13三體發(fā)生于1個(gè)雙絨毛膜性的雙胎之一A胎，B胎正常，該孕婦僅進(jìn)行了B超檢測(cè)結(jié)果顯示有一胎異常，其并未進(jìn)行唐篩等相關(guān)檢查。另一名胎兒診斷為XO的孕婦B超提示15周胎兒胸腔積液，同時(shí)也未進(jìn)行其他相關(guān)篩查檢測(cè)。

所有6例數(shù)目異常樣本中有5例母親年齡小于35歲。一直以來(lái)，母親年齡在評(píng)估胎兒染色體風(fēng)險(xiǎn)高低中占有重要地位，高齡孕婦被認(rèn)為是必要進(jìn)行產(chǎn)前診斷的主體。但從本研究的異常分布情況來(lái)看，更需要關(guān)注母親年齡小于35歲孕婦的胎兒情況。

已有報(bào)道支持上一次胎兒染色體異常的孕婦生育下一次異常胎兒的風(fēng)險(xiǎn)有所增加。由于本研究異常例數(shù)不多，我們并未對(duì)不同孕次和產(chǎn)次中異常胎兒染色體分布差異進(jìn)行比較。期望以后收集更多的數(shù)據(jù)以擴(kuò)大研究。

本研究中成功對(duì)1例XO（65%）／XX（35%）嵌合體進(jìn)行了診斷，并且嵌合比例與核型分析保持一致。異常XO比例大于60%，所以容易判斷其為嵌合型。另外，我們還正確診斷1例血性羊水的標(biāo)本為21三體。在筆者收集的249例羊水中大約有20%樣本離心后明顯或者微量的血污染，按照操作手冊(cè)要求FISH實(shí)驗(yàn)室接受的羊水須為無(wú)外觀母血污染的樣本，但實(shí)際臨床醫(yī)生在羊膜腔穿刺過(guò)程中，由于胎盤(pán)的位置等原因?qū)е掠心秆廴?，并不能拒絕對(duì)這些樣本進(jìn)行檢測(cè)。這都需要在診斷中根據(jù)樣本的情況排除影響因素最終才能準(zhǔn)確診斷。所以，在FISH診斷方面還有各個(gè)實(shí)驗(yàn)室具體的經(jīng)驗(yàn)，最終的目的就是保證診斷的準(zhǔn)確性。

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