建立猴青光眼模型的方法

楊宏方 孫興懷

猴作為一種特殊實(shí)驗(yàn)動物，一方面，它與人同屬靈長類，眼部結(jié)構(gòu)、視覺中樞以及疾病進(jìn)程與人類最為相似，和其他動物相比，研究結(jié)果也最易推廣到人;另一方面，猴價格高昂，來源不易，故研究中慎重采用。在青光眼領(lǐng)域，已有數(shù)種動物造模方法，且研究人員在不斷努力尋找穩(wěn)定、有效的新方法，但由于猴的特殊性和珍貴性，用于猴的造模方法相對局限。本文就幾種能夠運(yùn)用于猴的成熟青光眼造模方法作一總結(jié)，希望能為將來計(jì)劃采用猴作為青光眼實(shí)驗(yàn)動物的同道提供參考，同時也希望在此基礎(chǔ)上激發(fā)出更多關(guān)于猴青光眼造模方法的新思考。

猴的一個生命年相當(dāng)于人類的3～3.5個生命年，不同種類猴子的眼球大小不一。目前用于制作青光眼模型的猴子有恒河猴(rhesus monkeys，Macaca mulatta)，食蟹猴(cynomolgus monkeys，Macaca fascicularis)，夜猴(owl monkeys，Aotus trivirgatus)，以及松鼠猴(squirrel monkeys，Saimiri sciurea)。其中，國際上報(bào)道較多的是恒河猴(年齡9～16歲)和食蟹猴(年齡6～12歲)。Nork等［1］研究發(fā)現(xiàn)，由于不同種類猴視網(wǎng)膜細(xì)胞的密度、數(shù)量、形態(tài)有差異，視覺電生理尤其是多焦視網(wǎng)膜點(diǎn)圖檢測的結(jié)果不同，以至于何種猴更適于作為研究對象，目前尚無定論。

1 慢性高眼壓模型

1.1 激光光凝小梁網(wǎng) 1974年Gaasterland和Kupfer首先使用氬激光對恒河猴前房角小梁網(wǎng)區(qū)行重復(fù)全周光凝，產(chǎn)生類似于人類慢性開角型青光眼的表現(xiàn)。1983年Quigley和 Hohman對其方法進(jìn)行改進(jìn)，將獼猴全身麻醉后在房角鏡下激光瞄準(zhǔn)功能小梁網(wǎng)區(qū)進(jìn)行擊射，使擊射區(qū)小梁組織發(fā)白或稍變黃，相鄰2個擊射點(diǎn)的燒灼斑相連續(xù)。如此行270～360°范圍擊射，導(dǎo)致初期小梁組織細(xì)胞崩解以及后續(xù)小梁組織的增殖及纖維化，瘢痕形成，部分功能性房角關(guān)閉，房水流出阻力增加，眼壓波動性上升。該法簡稱“激光光凝法”，已成為比較理想的制造慢性高眼壓模型的方法。

目前使用的激光主要有2種:氬激光(512 nm)和半導(dǎo)體泵浦固體倍頻532激光。兩者光凝的操作基本一致，不同之處在于具體參數(shù)。不同文獻(xiàn)報(bào)道有所差異，我們綜合各家之見后推薦采用參數(shù)如下:氬激光(512 nm)——光斑直徑50～75μm，功率1000～1500 mW，時間 0.5～1.0 s，全房角光凝 80～250點(diǎn)，平均181點(diǎn)。若總能量=每次光凝時長×功率×光凝次數(shù)，則最終制?？偰芰科骄_(dá)80～90 J［2］。倍頻532激光——光斑直徑50μm，功率1200～1500 mW，時間0.2 s，全房角光凝9～128點(diǎn)，平均124點(diǎn)［3］。兩者相比，倍頻532激光儀器小巧輕便，易于攜帶，光凝時間短，價格也低，有推廣價值。

光凝后，房角鏡下可見到房角區(qū)散在的色素堆積與發(fā)白區(qū)域相間。早期由于反應(yīng)性的急性前葡萄膜炎，大部分眼會出現(xiàn)眼壓暫時降低，可局部適當(dāng)給予典必舒眼膏抑制炎癥。數(shù)天到1周后眼壓開始升高，升高范圍為24～50mm Hg(1mm Hg=0.133 kPa)，可平均維持(21 ±15)個月［4］。文獻(xiàn)報(bào)道期間不需要重復(fù)干預(yù);但實(shí)際操作中我們［5］發(fā)現(xiàn)，光凝后眼壓都會緩慢下降至正常，需補(bǔ)打激光。國內(nèi)曾有文獻(xiàn)［4］報(bào)道間隔2周行3次擊射即可形成持續(xù)穩(wěn)定的高眼壓模型，若3次擊射后無效則提示難以制成高眼壓模型。

該法經(jīng)久不衰，總結(jié)其優(yōu)勢:首先，具有非侵襲性，光凝導(dǎo)致的輕到中度炎癥在2周內(nèi)即消退;其次，相對于其他制模方法，眼內(nèi)壓波動較小;第三，隨著視覺電生理檢測在青光眼研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，此種造模方法保持屈光間質(zhì)清晰，不對視覺電生理檢查造成干擾。

但也有其缺點(diǎn):①激光光凝造模后眼壓常常超過所期望的升高范圍(30～40mm Hg)，或有較大波動，尤其是當(dāng)眼壓波動過大達(dá)到阻斷視網(wǎng)膜血供可能的時候，給最終視神經(jīng)損傷的解釋帶來困難。為了避免這種情況，常使用眼局部降眼壓藥物將眼壓控制在一定范圍內(nèi)。但有一個疑問:這些藥物對于眼的微觀結(jié)構(gòu)以及要檢測的分子生物學(xué)以及生化指標(biāo)有無影響?②有報(bào)道激光可能導(dǎo)致眼球前段發(fā)生變化［4］，如虹膜周邊與后部小梁網(wǎng)發(fā)生前粘連、角膜周圍新生血管、虹膜萎縮、虹膜晶狀體粘連、色素沉積于角膜內(nèi)皮和晶狀體表面等。③該制模方法對設(shè)備要求高，且操作者的操作經(jīng)驗(yàn)很重要，激光擊射不足則眼壓不會升高，擊射過量又易擊穿小梁網(wǎng)，眼壓不升反降。

1.2 前房注射外來物 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，自該法誕生以來，在嚙齒類動物［6-7］中廣泛采用，可用的外來物質(zhì)有很多，如糜蛋白酶、甲基纖維素、復(fù)方卡波姆、乳膠微球、磁珠、透明質(zhì)酸鈉等。而國際上使用于猴的前房注射物有血影細(xì)胞和乳膠微球，血影細(xì)胞法由于各種缺陷正逐漸被淘汰，乳膠微球法則是后起之秀，且在逐步改進(jìn)中，值得介紹。

乳膠微球法實(shí)施于猴的經(jīng)典案例來自于Weber等［8］，他們將直徑為10μm的無菌微球在磷酸鹽緩沖液中制成混懸液，每周1次通過玻璃微管緩慢注射4×105微球/100 μL到猴的眼前房。微球質(zhì)量輕，在前房內(nèi)隨房水而移動，大部分微球經(jīng)小梁網(wǎng)進(jìn)入Schlemm管，還有部分進(jìn)入脈絡(luò)膜上腔和角膜緣的房水流出管道;且微球聚集成為微球團(tuán)后，能更好阻斷小梁網(wǎng)房水通路。此外，外來物造成小梁網(wǎng)炎癥，也會產(chǎn)生高眼壓效應(yīng)［9］。根據(jù)目標(biāo)眼壓和實(shí)時眼壓的差值、前一次注射后眼部的反應(yīng)等調(diào)整注射劑量重復(fù)注射，共注射8～12次開始出現(xiàn)眼壓穩(wěn)定升高，后續(xù)的注射可以使眼壓升高維持1～3周。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與 Urcola［10］、Cone 等［7］報(bào)道一致，使用每周前房聯(lián)合注射乳膠微球和羥丙基甲基纖維素(hydroxypropylmethylcellulose，HPM)或10mg/mL透明質(zhì)酸鈉的方法，誘導(dǎo)眼壓升高更快，最高眼壓更高。

相對于激光光凝法，該法操作簡單，可重復(fù)性強(qiáng)，炎癥反應(yīng)輕微。若注射劑量適宜，注射后24～48 h可達(dá)視軸清澈，方便觀察眼底，監(jiān)測疾病進(jìn)程。多次注射后即使有微球黏附在虹膜表面，也不影響虹膜功能。增大注射的頻率可以達(dá)到較高且較為平穩(wěn)的眼壓。眼壓一旦升高，不易自行回落至正常，模型可保持18～144周［9］，這是其他方法都無法實(shí)現(xiàn)的。

該法存在的缺陷:①劑量或頻率不當(dāng)導(dǎo)致眼壓大波動。分析其可能原因，微球首先阻塞小梁網(wǎng)，合并小梁網(wǎng)細(xì)胞炎癥腫脹導(dǎo)致眼壓升高，眼壓增高又迫使Schlemm管內(nèi)壁內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)變得疏松、細(xì)胞旁間隙變大，微球進(jìn)入這些間隙中后進(jìn)一步擴(kuò)張細(xì)胞旁通道，房水經(jīng)此通道流出增多，眼壓下降，直至再次注入乳膠微球。②在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，造模后部分動物的晝夜眼壓波動大于生理性晝夜波動，原因不明，需進(jìn)一步研究闡明。③注射劑量很有講究，若劑量太小(50 μL，2×105beads/injection)則眼壓無變化，需要反復(fù)多次的注射;若劑量太大(500 μL，2×106beads/injection)一方面會造成眼壓急劇升高或微球貼附于角膜內(nèi)表面，造成角膜內(nèi)皮失代償;另一方面大量游離的微球永久性附著在晶狀體前表面，對眼底觀察、視覺電生理檢測等造成困難。④由于微球會堵塞葡萄膜鞏膜房水引流途徑，若實(shí)驗(yàn)為了檢測以該途徑為靶點(diǎn)的抗青光眼藥物效用而建模的話，可能不建議使用［11］。

該法誕生之初由于引起嚴(yán)重的前房炎癥反應(yīng)、游離微球漂浮等原因，被認(rèn)為不宜推廣;但如今隨著材料和技術(shù)的不斷改進(jìn)，綜合考慮其優(yōu)缺點(diǎn)，前景廣闊。至于目前國際上繼Weber之后，未見他人采用該法建立猴慢性高眼壓模型的相關(guān)報(bào)道，主要還是因?yàn)椴辉冈谌绱速F重的動物上嘗試新方法，但不能因此而否定了它。如今，在乳膠微球的基礎(chǔ)上，研究人員又新研制了帶電荷微球、磁珠等［12］，通過吸附作用更加提高了造模的有效率和成功率;且我們已通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，前房注射磁珠不會對后續(xù)的功能磁共振檢查造成影響。但國內(nèi)外均未見有關(guān)應(yīng)用于猴的報(bào)道，期待今后有進(jìn)一步研究。

1.3 眼局部用激素 早在1964年就有人試圖用此法誘導(dǎo)非人靈長類動物的高眼壓模型，但沒有成功。Gerometta等［13］曾報(bào)道使用0.1%的地塞米松乙醇溶液3次/d給猴子滴眼，經(jīng)過4周，45%的猴子逐漸產(chǎn)生了高眼壓(眼壓平均升高10.6±3.6mm Hg)。而且激素誘導(dǎo)的高眼壓有可逆性和可重復(fù)性，但若首次使用激素?zé)o效則續(xù)用仍然無法產(chǎn)生有效的高眼壓。激素主要作用于小梁網(wǎng)區(qū)，通過小梁網(wǎng)激素受體介導(dǎo)肌動蛋白張力絲重組、可逆的肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)形成，并促進(jìn)黏多糖、彈力蛋白、纖連蛋白生成，蛋白酶活性和細(xì)胞的吞噬功能下降，造成細(xì)小的纖維樣細(xì)胞外基質(zhì)在鄰管區(qū)沉積增加，最終小梁網(wǎng)處無論是經(jīng)細(xì)胞還是細(xì)胞旁的房水流出均減少。由于激素的副作用，該模型目前僅用于模擬臨床激素性青光眼，不作為原發(fā)性青光眼的高眼壓模型。

2 猴的其他青光眼模型

2.1 正常眼壓性青光眼模型 近年來，越來越多的證據(jù)表明，正常眼壓性青光眼(normal tension glaucoma，NTG)患者血清和房水中內(nèi)皮素-1(ET-1)含量升高［14-16］，細(xì)胞內(nèi)皮素受體B表達(dá)增加;且嚙齒類動物實(shí)驗(yàn)證明ET-1通過內(nèi)皮素受體B作用，阻斷視神經(jīng)軸突的軸漿運(yùn)輸，造成視神經(jīng)損害［17-20］。另有研究［21］則在人體發(fā)現(xiàn)NTG患者靜脈用選擇性內(nèi)皮素A受體拮抗劑后，視網(wǎng)膜血流有所改善。此外，有研究［22］表示ET不僅作用于眼后段，則使血管收縮、視網(wǎng)膜和視盤的血供減少，而且作用于眼前節(jié)，使小梁網(wǎng)收縮，在一定程度上擾亂了小梁網(wǎng)房水引流途徑的自身調(diào)節(jié)功能。受此啟發(fā)，Cioffi等［23］利用滲透壓驅(qū)動原理，將ET-1通過迷你泵持續(xù)泵入獼猴視神經(jīng)球后始發(fā)段的神經(jīng)周圍區(qū)域，誘導(dǎo)產(chǎn)生慢性視神經(jīng)缺血模型，血流量減少可達(dá)36%，同時不影響IOP也不受IOP影響，可以作為NTG的模型。但也有研究者［24］使用同樣方法并未觀察到視盤有任何形態(tài)變化或者血流改變，可能與使用劑量、具體操作有關(guān)。作為一種新興的建模方法，目前國際上尚未達(dá)成共識，其具體作用機(jī)制以及操作方法有待進(jìn)一步研究。

2.2 急性眼壓升高模型 長久以來一直采用前房灌注生理鹽水，模仿一過性的房水生成增多，從而產(chǎn)生急性高眼壓。由于房水引流途徑未被破壞，停止灌注后經(jīng)過一段時間，眼壓會自行下降至初始水平。此法無更多創(chuàng)新，不贅述。

3 結(jié)語

青光眼建模成功的標(biāo)準(zhǔn)為組織病理學(xué)顯示視盤杯狀凹陷加深、篩板后凹、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞選擇性丟失、神經(jīng)纖維層變薄。高眼壓不是青光眼的唯一致病因素，但卻是一個確切的危險因素，因此建立高眼壓模型，尤其是慢性高眼壓模型成為研究青光眼疾病的關(guān)鍵。關(guān)于慢性高眼壓模型，無論是激光光凝小梁網(wǎng)還是前房注入外來物，都圍繞增加房水流出阻力來實(shí)現(xiàn)。相比之下，激光光凝法傳統(tǒng)、可靠，乳膠微球法及其衍生出來的一些方法更加方便、有效，期望有更多研究人員采用。正常眼壓性青光眼過去一直是造模的難點(diǎn)，現(xiàn)在ET法也帶來希望;而急性高眼壓模型則一貫通過前房灌注來實(shí)現(xiàn)。希望研究者按照自身實(shí)驗(yàn)要求，能在文中介紹的方法中找到適合自己的造模方法;也期待今后通過對以上方法的改進(jìn)或者創(chuàng)新，會有更加符合理想標(biāo)準(zhǔn)的建模方法出現(xiàn)。

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