肝纖維化分子研究進(jìn)展及其治療

石 慧 肖和杰

1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 (湖北宜昌，443002) 2.三峽大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院葛洲壩中心醫(yī)院

Friedman SL［1］在1985年首次發(fā)現(xiàn)肝星狀細(xì)胞 (hepatic stellate cell，HSC)是肝臟中主要的膠原蛋白產(chǎn)生細(xì)胞。過(guò)去5年在PubMed search中共發(fā)表近兩萬(wàn)篇相關(guān)文獻(xiàn)，最近的研究主要集中在上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、先天免疫、先天性突變、表觀遺傳學(xué)改變以及基因的單核苷酸多態(tài)性［2］。肝纖維化研究得到了全球性的關(guān)注，肝纖維化與乙型肝炎病毒 (HBV)和丙型肝炎病毒 (HCV)的感染、慢性酒精中毒、遺傳代謝疾病、化學(xué)毒物或藥物、肝臟淤血、寄生蟲(chóng)、脂肪肝等密切相關(guān)，是最終發(fā)展為肝癌的必經(jīng)階段。近年來(lái)隨著肝纖維化發(fā)病機(jī)制的進(jìn)展，肝纖維化被認(rèn)為具有可逆轉(zhuǎn)性，因此激發(fā)人們針對(duì)肝纖維化發(fā)生的信號(hào)傳導(dǎo)通路、細(xì)胞因子基因表達(dá)、HSC激活與凋亡過(guò)程等環(huán)節(jié)進(jìn)行抗肝纖維化基因治療。本文將綜述肝纖維化的最新研究進(jìn)展。

1 肝纖維化分子研究進(jìn)展

肝纖維化是肝臟對(duì)各種慢性肝損傷的代償反應(yīng)所形成的一種肝臟瘢痕組織，是慢性肝炎向肝硬化及肝癌發(fā)展的重要病理過(guò)程。其中HSC的激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞 (myofibroblast，MFB)是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，活化后的 HSC合成大量的細(xì)胞外基質(zhì) (extracellular matrix，ECM)，過(guò)多的ECM在肝臟內(nèi)不斷沉積并最終導(dǎo)致肝纖維化。因此，調(diào)節(jié)ECM的產(chǎn)生與肝纖維化的治療密切相關(guān)。

肝星狀細(xì)胞，又稱儲(chǔ)脂細(xì)胞，位于Disse間隙，緊貼肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞［3］。HSC最主要的功能是胞質(zhì)內(nèi)儲(chǔ)存維生素A，人體50%～80%的維生素A存在于肝臟，而其中90%在HSC，當(dāng)人體需要維生素A時(shí)便將其分泌到門(mén)靜脈血中。肝損傷發(fā)生時(shí)，肝細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子，使炎性細(xì)胞趨化聚集，Kupffer細(xì)胞激活，激活的Kupffer細(xì)胞、浸潤(rùn)的單核細(xì)胞、活化聚集的血小板以及損傷的肝細(xì)胞產(chǎn)生血小板衍生生長(zhǎng)因子 (platelet derived growth factor，PDGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (transforming growth factor β，TGF-β)，這些因子與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后引起一系列胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)?；罨腍SC不僅失去脂滴，具有收縮功能，表達(dá)結(jié)蛋白、α-肌動(dòng)蛋白 (αsmooth muscle actin，α-SMA)等胞內(nèi)蛋白，還大量合成Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白，使ECM大量沉積，形成肝纖維化。HSC的活化受轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，比如AP-1、JUN D、Sp1、克魯佩爾樣因子6(KLF6)和核因子-kappa B(nuclear factor kappa B，NF-κB)，最終導(dǎo)致 TGF-β轉(zhuǎn)錄上調(diào)。這個(gè)過(guò)程中，Smad、Ras、Raf-1和絲裂原蛋白激酶 (mitogen activated protein kinase，MAPK)等胞內(nèi)信號(hào)分子發(fā)揮了非常重要的作用［4］。另外，基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑 (tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)增多，從而抑制ECM的降解，導(dǎo)致炎癥肝臟中ECM積累增多。在HSC活化過(guò)程中瘦素和脂肪細(xì)胞因子也值得注意?；罨腍SC其特征也表現(xiàn)在TGF-β、PDGF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管緊張素-Ⅱ、內(nèi)皮素-1等因子的表達(dá)增多［5］。

自1980年以來(lái)有大量文獻(xiàn)報(bào)道肝纖維化進(jìn)程中HSC的作用，最近用嚙齒類動(dòng)物和人損傷肝模型研究表明起源于骨髓的間充質(zhì)細(xì)胞也參與肝纖維化的過(guò)程［6］。類似地，循環(huán)中的纖維細(xì)胞和門(mén)靜脈結(jié)締組織中成纖維細(xì)胞也參與纖維化［7，8］。

2 肝臟中纖維化持續(xù)存在

周圍細(xì)胞產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激持續(xù)刺激HSC使其活化，MFB的存在是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的主要原因。損傷肝細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)氧化脂質(zhì)及肝細(xì)胞線粒體和肝細(xì)胞膜裂解產(chǎn)物產(chǎn)生的活性氧 (reactive oxygen species，ROS)能激活HSC［9］。輔酶Ⅱ是參與活性氧合成系統(tǒng)中重要成分，可能成為一個(gè)抗纖維化治療靶點(diǎn)。這種酶可能由HSC誘導(dǎo)產(chǎn)生，能阻止細(xì)胞凋亡，血管緊張素受體拮抗劑氯沙坦能降低其表達(dá)，引起Ⅰ型膠原和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)的產(chǎn)生減少［10］。另外，二價(jià)鐵離子觸發(fā)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生OH· (羥自由基)從而導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡，肝細(xì)胞的凋亡又激活HSC，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化過(guò)程。

TGF-α、β、胰島素樣生長(zhǎng)因子及其結(jié)合蛋白、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (hepatic growth factor，HGF)、VEGF、IL(白介素)-1、IL-6都能被肝細(xì)胞釋放從而激活HSC。其中TGF-β1通過(guò)對(duì)HSC、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞等的直接作用以及對(duì)與纖維化有關(guān)的其他生長(zhǎng)因子和各種酶類施加廣泛影響，從而促進(jìn)ECM合成并抑制其降解 ，在肝纖維化的啟動(dòng)、進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵性作用［11］。另外，發(fā)生肝損傷時(shí)，Kupffer細(xì)胞通過(guò)氧化應(yīng)激被激活，同樣也通過(guò)Toll-樣受體 (TLR)-4和CD14(基于腸道菌群)被內(nèi)毒素脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)激活［12］?；罨?Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生的單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)和骨橋蛋白與肝臟內(nèi)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)有關(guān)［13］。另外，活化的Kupffer細(xì)胞也產(chǎn)生PDGF和 TGF-β1激活 HSC。動(dòng)物模型中，用氯化釓去除Kupffer細(xì)胞能改善肝纖維化，這說(shuō)明了Kupffer細(xì)胞在肝纖維化中的積極作用。

最近研究發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化過(guò)程中除了巨噬細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞外，NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞也發(fā)揮著重要作用，這些細(xì)胞的纖維化作用可被TLR系統(tǒng)和NF-κB信號(hào)途徑調(diào)節(jié)。總而言之，HSC和MFB與這些免疫細(xì)胞相互作用共同參與肝血竇局部炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。

近兩年來(lái)，Hezode等和Teixeira-Clerc等先后發(fā)現(xiàn)，大麻素受體在慢性肝病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著非常獨(dú)特的作用［14］。大麻素的3種主要成分為四氫大麻酚、大麻酚和大麻二酚，大麻素受體-1(cannabinoid-1receptor，CB1)和大麻素受體-2(cannabinoid-2 receptor，CB2)是體內(nèi)主要存在的兩類大麻素受體。它們都是G蛋白偶聯(lián)受體。近年研究發(fā)現(xiàn)，肝損傷時(shí)大麻素受體在肝臟的多種細(xì)胞如肝細(xì)胞、肝成纖維母細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞表達(dá)都增強(qiáng)［15］。Teixeira-Clerc等在對(duì)人的肝纖維化組織樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色時(shí)，發(fā)現(xiàn)樣本中肝成纖維母細(xì)胞的CB1顯著上調(diào);在鼠的急性肝損傷模型中，CB1的激活會(huì)誘導(dǎo)肝中兩種纖維化標(biāo)志物——TGF-β1和α-SMA的表達(dá)，當(dāng)給予CB1拮抗劑利莫那班(rimonabant;SR141716A)后，這兩種標(biāo)志物的生成減少［16］。

分子生物技術(shù)分析幾種蛋白的磷酸化狀態(tài)、靶基因的甲基化、mRNA的穩(wěn)定性和miRNA(miRNA)水平也與HSC和MFB的激活有關(guān)。例如，活化HSC能觸發(fā)其NF-κB的RelA亞單位的Ser536磷酸化，從而阻止HSC的凋亡。另外，miRNA-132能阻止CpG甲基化蛋白的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ (PPAR-γ) 和MFB激活［17］。有報(bào)道m(xù)iRNA-29b能通過(guò)與基因3'非翻譯區(qū)結(jié)合和下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Sp-1，使LX-2細(xì)胞膠原蛋白1A1轉(zhuǎn)錄減弱，LX-2細(xì)胞是一種人永生化的星狀細(xì)胞系株，不依賴Smad信號(hào)途徑［18］。

最近發(fā)現(xiàn)了人類基因變異與肝纖維化也有關(guān)，這些變異大部分是SNP(單核苷酸多態(tài)性)的頻繁突變，例如，在SNP中，TGF-β的 Leu10Pro、血管緊張素的 Arg25Pro和 G-6A、腫瘤壞死因子 (TNF)-α和 IL-10的 C-592A/-819/G-1082A都被報(bào)道過(guò)［19］。7-基因危險(xiǎn)指數(shù) (CRS) 由7種不同的SNP組成，被報(bào)道與纖維化過(guò)程有密切關(guān)系。

3 肝纖維化逆轉(zhuǎn)

臨床上許多資料顯示肝硬化不僅可逆轉(zhuǎn)，而且可以修復(fù)肝功能，改善患者的預(yù)后。因此，抗肝纖維化治療可以在未找到病因前盡早開(kāi)展。肝纖維化逆轉(zhuǎn)的分子機(jī)制有以下四個(gè)方面：①肝細(xì)胞再生;②活化的HSC逆轉(zhuǎn);③MFB凋亡;④積累的ECM被降解。HGF是由一個(gè)α鏈和β鏈組成的異二聚體，具有強(qiáng)烈絲裂原活性及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與形態(tài)調(diào)節(jié)功能，是目前所知的最強(qiáng)有力的肝細(xì)胞增殖因子。另外，活化的HSC在培養(yǎng)過(guò)程中過(guò)表達(dá)PPAR-γ或甾醇調(diào)節(jié)結(jié)合蛋白能使HSC發(fā)生逆轉(zhuǎn)。活化的HSC凋亡主要通過(guò)以下信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)：Fas/Fas-L，p75/NGF，苯二氮卓類受體 (PBR/PBR2-L)及其他途徑。體外培養(yǎng)的HSC或MFB對(duì)于CD95和NK細(xì)胞分泌的TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體 (TRAIL)很敏感，極易被誘導(dǎo)發(fā)生凋亡。肝細(xì)胞分泌的神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (NGF)通過(guò)p75/NGF信號(hào)通路也能誘導(dǎo)活化的HSC凋亡。有報(bào)道在肝纖維化過(guò)程中有NK細(xì)胞參與調(diào)節(jié)，在小鼠模型，用Anti-asialo-GM1去除NK細(xì)胞作用后能加速肝纖維化進(jìn)程;相反，用聚肌胞 (poly-IC)，一種TLR3配體活化NK細(xì)胞則能延緩肝纖維化進(jìn)程。對(duì)于表達(dá)NK細(xì)胞活化受體NKG2D的活化型HSC，NK細(xì)胞的殺傷作用則受到限制。臨床上觀察肝移植患者也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象，肝移植患者用了環(huán)孢素、糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑后肝纖維化進(jìn)程加快［20］。

基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)是一類鋅離子依賴性內(nèi)源性蛋白水解酶，主要功能是降解ECM和基底膜。MMP分為以下幾類：①間質(zhì)膠原酶 (MMP-1、-8、-13、-18);②明膠酶(MMP-2、-9);③基質(zhì)降解酶 (MMP-3、-7、-10、-11);④膜型 MMPs(MMP-14、-15、-16、-17、-24、-25);⑤金屬?gòu)椥缘鞍酌?(MMP-12)。HSC分泌MMP-2、-9和-13(在人類為MMP-1)。因?yàn)镸MP-1是分解Ⅰ型膠原蛋白最關(guān)鍵的膠原酶，是改善肝纖維化的主要元素;然而，MMP活性也調(diào)節(jié)TIMP的活性，局部MMP和TIMP的平衡是肝纖維化的關(guān)鍵［21］。有研究發(fā)現(xiàn)肝纖維化患者血液中T細(xì)胞衍生的微粒能誘導(dǎo)HSC的纖維分解能力［22］。

4 肝纖維化的治療

抗肝纖維化治療策略包括以下幾點(diǎn)：①調(diào)控HSC和MFB活化;②抑制膠原蛋白積累;③抑制HSC和MFB增殖。抑制HSC的活化是減緩纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵?；罨腒upffer細(xì)胞引起的氧化應(yīng)激或肝細(xì)胞損傷都會(huì)誘導(dǎo)HSC活化?？寡趸瘎┤缇S生素E等抑制HSC激活，保護(hù)肝細(xì)胞，從而減輕實(shí)驗(yàn)性肝纖維化。因此，抗氧化劑是治療肝纖維化的一種選擇。一些能抑制HSC活化過(guò)程中重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)也有治療肝纖維化的可能，如磷酸二酯酶抑制劑己酮可可堿 (pentoxifylline，PTX)。臨床上用于清除HCV和HBV的IFN(干擾素)-α和β能通過(guò)胞內(nèi)信號(hào)分子調(diào)節(jié)膠原蛋白基因的表達(dá)，比如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、轉(zhuǎn)錄激活物-1(Stat-1)和p300。聚乙二醇-IFN-α在循環(huán)中比傳統(tǒng)的IFN存留更長(zhǎng)時(shí)間，而且活化依賴I型IFN受體的Janus kinase/Stat-1信號(hào)通路，結(jié)果HSC活化受到更強(qiáng)抑制。如IL-10抑制肝纖維化表現(xiàn)在上調(diào)MMP基因的表達(dá)及抑制HSC合成膠原的功能。

盡管現(xiàn)在肝纖維化方面已經(jīng)取得很大進(jìn)步，尤其是肝纖維化分子調(diào)控機(jī)制的建立以及基因治療。但是肝纖維化過(guò)程涉及多因子及多信號(hào)通路相互交錯(cuò)，它們之間是怎么相互作用，孰輕孰重，目前為止還沒(méi)有統(tǒng)一的答案。當(dāng)前針對(duì)TGF-β、gremlin1、PDGF、CTGF(結(jié)締組織生長(zhǎng)因子)等因子的基因調(diào)節(jié)治療尤為引人注目，顯示出巨大的潛力，相信在不久的將來(lái)，基因治療會(huì)成為治療肝纖維化的主導(dǎo)方向。

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