非小細(xì)胞肺癌EGFR酪氨酸激酶抑制劑的耐藥機(jī)制及逆轉(zhuǎn)

潘晶晶， 馮繼鋒

表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)信號(hào)通路參與控制細(xì)胞的存活、增殖、血管生成、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移等過(guò)程［1］，因此通過(guò)干預(yù)EGFR酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)已成為近年來(lái)腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。EGFR特異性小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)吉非替尼和厄洛替尼是治療非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma，NSCLC)的小分子靶向藥物。2004年，多個(gè)權(quán)威期刊發(fā)表了關(guān)于EGFR突變與 TKI藥物敏感性關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)EGFR突變的患者對(duì)TKI藥物有很好的反應(yīng)性［2-3］，特別是具有19外顯子密碼子746～750的缺失突變，21外顯子密碼子858替代突變(L858)的患者對(duì)TKI高度敏感。盡管如此，原發(fā)性及繼發(fā)性耐藥仍是亟待解決的問(wèn)題。到目前為止，很多關(guān)于耐藥的機(jī)制被報(bào)道，如EGFR基因20外顯子的插入突變及KRAS基因突變與原發(fā)性耐藥有關(guān);EGFR基因的二次突變，MET基因的擴(kuò)增以及HGF基因的過(guò)表達(dá)與繼發(fā)性耐藥有關(guān)等。本文就EGFR靶向治療藥物的臨床應(yīng)用，耐藥機(jī)制及相關(guān)解決方法進(jìn)行綜述。

1 EGFR-TKI在NSCLC臨床治療中的應(yīng)用

EGFR-TKI通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域上ATP位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，可逆性、選擇性抑制與EGFR相關(guān)的酪氨酸激酶活性及細(xì)胞內(nèi)磷酸化過(guò)程，進(jìn)而抑制EGFR下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而阻斷EGFR誘導(dǎo)的體外腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，加速細(xì)胞凋亡、拮抗血管生成、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、阻斷腫瘤生長(zhǎng)。

1.1 吉非替尼

吉非替尼是最早用于治療NSCLC的靶向藥物之一，已有多項(xiàng)國(guó)際多中心臨床研究證實(shí)吉非替尼治療肺腺癌有效。IPASS研究是在東亞，對(duì)非吸煙或很少吸煙的患者進(jìn)行吉非替尼與卡鉑+紫杉醇聯(lián)合化療的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示在所有患者中吉非替尼組比卡鉑－紫杉醇組有更長(zhǎng)的無(wú)疾病進(jìn)展(PFS)，在EGFR突變的患者中吉非替尼組的PFS更是明顯長(zhǎng)于聯(lián)合化療組(9.5個(gè)月 vs.6.6個(gè)月)［4］。IDEAL-1及IDEAL-2為兩項(xiàng)多中心Ⅱ期臨床試驗(yàn)，結(jié)果也均顯示吉非替尼對(duì)復(fù)治的進(jìn)展期NSCLC患者具有令人鼓舞的抗腫瘤活性和耐受性［5-6］。但基于吉非替尼與細(xì)胞毒藥物化療的協(xié)同作用研究結(jié)果則不滿(mǎn)意，一項(xiàng)Ⅲ期臨床試驗(yàn)INTACT-1，在GP方案中加入吉非替尼卻未顯示出任何獲益。另一項(xiàng)Ⅲ期臨床研究INTACT-2則對(duì)吉非替尼聯(lián)合TC作為晚期NSCLC一線(xiàn)治療方案作了評(píng)價(jià)，顯示在化療的基礎(chǔ)上加用吉非替尼，OS、RR及無(wú)病生存期(DFS)也無(wú)明顯改善［7］。值得注意的是，在 INTACT試驗(yàn)中的312例患者中有32例(10%)被檢測(cè)出有EGFR突變，而依據(jù)EGFR基因型判斷對(duì)吉非替尼聯(lián)合化療的反應(yīng)雖無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但EGFR突變的NSCLC患者應(yīng)用吉非替尼后生存率卻顯著提高。

1.2 厄洛替尼

厄洛替尼是一種可逆的ATP競(jìng)爭(zhēng)性EGFRTKI，通過(guò)抑制EGFR自身磷酸化而抑制下游信號(hào)傳導(dǎo)與細(xì)胞增殖。Ⅲ期臨床研究BR.21試驗(yàn)結(jié)果顯示，與安慰劑相比，口服厄羅替尼150mg/d可顯著延長(zhǎng)晚期NSCLC患者生存期，改善生活質(zhì)量［8］。在2009年ASCO年會(huì)上，來(lái)自西班牙的數(shù)據(jù)也提示厄羅替尼單藥治療晚期EGFR突變的NSCLC患者，中位疾病進(jìn)展時(shí)間(TTP)達(dá)到14個(gè)月，中位生存期為27個(gè)月，明顯優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)一線(xiàn)化療方案。

1.3 其他

不可逆的EGFR抑制劑包括 BIBW2992、BMS-690514、PF-00299804和EKB-569等，它們的療效尚待評(píng)估［9］。還有針對(duì)多靶點(diǎn)信號(hào)通路的藥物，如ZD6474(vandetanib)和BMS-690514，目前也都處于臨床試驗(yàn)階段。

2 EGFR突變與TKI敏感性的關(guān)系

EGFR的激活性突變集中在四個(gè)密碼子(18～21)，分別為外顯子18的單堿基替代、外顯子19的缺失、外顯子20的插入/重迭及外顯子21的單堿基替代L858R的點(diǎn)突變。其中19外顯子的缺失突變和21外顯子的點(diǎn)突變占所有突變的90%［10-11］。在所有突變中，G719C(外顯子18)、E746-A750(外顯子19)、R776C(外顯子20)及L858R(外顯子21)的突變與TKI敏感性有關(guān)。上述突變陽(yáng)性者對(duì)EGFRTKI的有效率為50% ～80%，而野生型患者的有效率僅為10% ～15%。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，EGFR突變?cè)趤喼奕?、女性、非吸煙及腺癌患者中常?jiàn)，而突變患者對(duì)吉非替尼和厄洛替尼高度敏感，但TKI并非對(duì)所有EGFR基因突變的肺癌患者有效，一些基因突變患者并不能從TKI治療中獲益，同時(shí)約18%的EGFR未突變的患者卻對(duì)TKI存在部分反應(yīng)性［12］。

3 EGFR-TKI的耐藥機(jī)制

3.1 原發(fā)性耐藥機(jī)制

原發(fā)性耐藥是指首次使用TKI治療即產(chǎn)生的耐藥，約有60%的肺癌患者為T(mén)KI原發(fā)性耐藥。目前認(rèn)為，KRAS突變和EGFR外顯子20的插入突變與TKI的原發(fā)性耐藥相關(guān)［13-14］。Pao 等［15］共收集了60例首次TKI單藥化療的肺腺癌患者，有38例對(duì)TKI不敏感，其中9例存在KRAS的基因突變;而在客觀緩解的21例患者中均無(wú)KRAS突變。由此推斷KRAS基因突變與肺腺癌患者對(duì)TKI的原發(fā)耐藥密切相關(guān)。Eberhand等［16］也發(fā)現(xiàn)具有KRAS突變的患者不僅沒(méi)有從厄洛替尼與化療聯(lián)合應(yīng)用中獲益，而且與單純接受化療的患者相比預(yù)后更差。需要注意的是，KRAS突變與EGFR突變是不共存的，因此對(duì)沒(méi)有EGFR突變的患者是否選擇TKI治療主要應(yīng)參考KRAS基因的突變情況。

3.2 獲得性耐藥機(jī)制

獲得性耐藥的確切機(jī)制目前仍不清楚。目前幾個(gè)潛在的假說(shuō)有:二次突變學(xué)說(shuō)，Met受體酪氨酸激酶基因擴(kuò)增學(xué)說(shuō)及其他受體酪氨酸激酶的過(guò)度表達(dá)學(xué)說(shuō)［17-18］。

3.2.1 二次突變學(xué)說(shuō) T790M的二次突變最普遍，在約50%的TKI耐藥患者中出現(xiàn)，其他位點(diǎn)的二次突變相對(duì)少見(jiàn)。(1)T790M突變:EGFR基因外顯子20在TKI治療過(guò)程中出現(xiàn)二次突變，導(dǎo)致EGFR 790位點(diǎn)上的蘇氨酸(threonine)被甲硫氨酸(methionine)取代，結(jié)果在該位點(diǎn)上引入了一條較大的氨基酸側(cè)鏈，構(gòu)成空間位阻，因此阻止 TKI和EGFR-TK催化域中的Mg-ATP位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，而ATP與酪氨酸激酶的結(jié)合未受影響，激酶繼續(xù)得以磷酸化［19］。Bell等［20］對(duì)一個(gè)肺癌家系的研究提示T790M并非致癌性突變，其在早期可能以微小克隆形式存在于癌組織中，隨著敏感克隆被TKI清除通過(guò)自然選擇的作用而被保留下來(lái)并進(jìn)一步擴(kuò)增凸顯，在腫瘤發(fā)展的繼承階段起重要作用。為進(jìn)一步證實(shí)T790M并非原發(fā)突變，Toyooka等［21］的研究證實(shí)在未接受TKI治療的患者中僅有0.5%可檢測(cè)出T790M突變。Onitsuka等［22］也進(jìn)行過(guò)類(lèi)似的研究，發(fā)現(xiàn)在10個(gè)吉非替尼繼發(fā)耐藥的患者中有7個(gè)檢測(cè)出T790M突變。(2)非T790M突變:與T790M突變相類(lèi)似的耐藥突變還有D761Y、L858R、L747S、E884K及G796A等突變，他們的總發(fā)生率低于5%。第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的非T790M突變的是D761Y，通常與L858R突變并存的，兩位點(diǎn)同時(shí)突變與L858R突變相比更容易對(duì)吉非替尼耐藥，但與T790M突變相比，耐藥可能性要小很多［23］。L747S、L858R 同時(shí)突變也比單純L858突變?cè)隗w外對(duì)吉非替尼和厄洛替尼更容易耐藥。一項(xiàng)關(guān)于L858R、L747S和L858R、D761Y突變的體外臨床試驗(yàn)顯示當(dāng)吉非替尼和厄洛替尼達(dá)到1uM時(shí)可以阻止這些突變，說(shuō)明可以通過(guò)TKI的劑量轉(zhuǎn)換即能解決對(duì)吉非替尼的耐藥［24］。Choong等［25］報(bào)道了1例從未吸煙的70歲肺腺癌的日裔女性，接受EGFR-TKIs治療失敗后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了E884K和L858R體細(xì)胞突變，提示這兩種突變類(lèi)型可能參與 TKI耐藥的發(fā)生。Uramoto等［26］報(bào)道EGFR外顯子20的G796A突變也可能參與了吉非替尼耐藥的發(fā)生。

3.2.2 c-MET 擴(kuò)增學(xué)說(shuō) 2007年，Dana-Farber腫瘤研究中心報(bào)道MET基因的擴(kuò)增與吉非替尼的獲得性耐藥有關(guān)。研究顯示，MET是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的受體，編碼HGF酪氨酸激酶受體的跨膜區(qū)，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和擴(kuò)增有關(guān)。MET基因的擴(kuò)增在未治療的NSCLC中很少見(jiàn)，但是在對(duì)TKI獲得性耐藥的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)MET基因的擴(kuò)增，從而提示其與另一種新的耐藥機(jī)制有關(guān)［27］。Engelman等［18］在18例已被吉非替尼誘導(dǎo)耐藥的肺癌細(xì)胞株中檢測(cè)出4例MET基因擴(kuò)增，結(jié)果顯示MET基因擴(kuò)增可誘導(dǎo) HER3(ErbB3)磷酸化，使 PI3K/Akt通路持續(xù)活化，從而導(dǎo)致吉非替尼繼發(fā)耐藥的發(fā)生。

3.2.3 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子過(guò)表達(dá)學(xué)說(shuō) 2008年，日本的一家研究機(jī)構(gòu)報(bào)道肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的過(guò)表達(dá)與EGFR-TKI的耐藥有關(guān)。HGF通過(guò)MET的磷酸化降低了PI3K/AKT通路的恢復(fù)。盡管MET基因擴(kuò)增激活了與ErbB3有關(guān)的下游通路，HGF通過(guò)MET降低了下游通路的活性，這種激活不依賴(lài)ErbB3或者EGFR。研究發(fā)現(xiàn)HGF的過(guò)表達(dá)不僅存在于沒(méi)有T790M突變或MET基因擴(kuò)增的耐藥的腫瘤中，還在沒(méi)有EGFR敏感性突變的原發(fā)性耐藥腫瘤中存在［28］。Turke等［29］等通過(guò)檢測(cè)27 例腫瘤組織，通過(guò)對(duì)比用藥前與用藥后的腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)其中有16例在經(jīng)過(guò)TKI治療后出現(xiàn)HGF的顯著增高。Guix等［30］還發(fā)現(xiàn)HGF通過(guò)選擇性擴(kuò)增MET基因過(guò)表達(dá)的克隆從而發(fā)揮耐藥作用。盡管目前在獲得性耐藥的腫瘤中HGF出現(xiàn)的頻率尚不清楚，但是HGF與T790M突變共存的現(xiàn)象比較多。Yamada等［31］報(bào)道HGF的過(guò)表達(dá)不僅與可逆性EGFR-TKI耐藥有關(guān)，還與不可逆性EGFR-TKI耐藥有關(guān)。

3.2.4 其他學(xué)說(shuō) 由于ErbB3介導(dǎo)的P13K信號(hào)通路的持續(xù)激活和TKI耐藥相關(guān)，反之猜測(cè)P13K信號(hào)通路抑制成分的缺失在耐藥發(fā)生中舉足輕重;此外，通過(guò)mTOR-IGFIR起作用的信號(hào)通路也會(huì)使EGFR靶向治療有效的病例復(fù)發(fā)。由此，學(xué)者還提出了其他的耐藥機(jī)制，如細(xì)胞的程序性死亡，上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化及10號(hào)染色體q23D的缺失等。

4 耐藥逆轉(zhuǎn)的方法

4.1 不可逆性EGFR-TKI

吉非替尼和厄洛替尼都是可逆性EGFR-TKI，也被稱(chēng)為第一代EGFR-TKI，目前在研究中的第二代EGFR-TKI大多為不可逆的EGFR-TKI。通過(guò)共價(jià)結(jié)合于EGFR催化域ATP結(jié)合位點(diǎn)邊緣的cys-797，從而使藥物濃度大幅升高并提供持續(xù)的封鎖效應(yīng)，因此能進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制。目前進(jìn)入臨床試驗(yàn)的有同時(shí)抑制EGFR及HER2的雙重抑制劑 HKI-272［31］及 BIBW2992［32］，以及同時(shí)抑制EGFR，HER2和 HER4的三重抑制劑 PF-00299804［33］。體外研究表明 HKI-272對(duì)含有雙突變(對(duì)TKI敏感的突變?nèi)鏓GFR外顯子19缺失突變和外顯子21的L858R點(diǎn)突變及T790M突變)的肺癌細(xì)胞系有效，但不能完全阻斷T790M突變的信號(hào)傳導(dǎo)。臨床前試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BIBW2992對(duì)有繼發(fā)性耐藥突變T790M的腫瘤細(xì)胞有活性，盡管不可逆性EGFR-TKI能有效抑制含有T790M突變的腫瘤細(xì)胞，但是含有EGFR T790M擴(kuò)增的克隆無(wú)論是在體內(nèi)還是體外都迅速融合，從而導(dǎo)致對(duì)不可逆性EGFR-TKI耐藥。

4.2 MET抑制劑及HGF抑制劑

一項(xiàng)臨床前研究顯示了MET及HGF抑制劑的有效性，抑制MET基因擴(kuò)增的抑制劑PHA-665752及抑制HGF過(guò)表達(dá)的抑制劑PF2341066都被證實(shí)有臨床療效［34］。MET基因的擴(kuò)增與HGF的過(guò)表達(dá)通常是與T790M突變共存的，因此，要解決耐藥問(wèn)題，聯(lián)合使用不可逆性EGFR-TKI及MET抑制劑正在臨床研究中。

4.3 p53 抑制劑

大多對(duì)吉非替尼有效的患者存在EGFR突變，但并不是所有EGFR突變患者對(duì)EGFR-TKI有效，而一些沒(méi)有EGFR突變的患者又能獲得療效，這表明還存在決定患者對(duì)吉非替尼敏感性的其他因素。腫瘤抑制基因p53能通過(guò)調(diào)節(jié)NSCLC中的Fas促進(jìn)吉非替尼誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制和凋亡，p53的突變常與藥物耐藥相關(guān)。Jin等［35］將吉非替尼用于人NSCLC株NCI-H1299和A549，這兩種細(xì)胞株均沒(méi)有EGFR-TK突變，研究發(fā)現(xiàn)NCI-H1299(存在p53無(wú)效基因型)比A549細(xì)胞株(存在野生型p53)對(duì)吉非替尼更為耐藥(NCI-H1299 IC50為40 μmol/L，A549 IC50為5 μmol/L)。在穩(wěn)定的 H1299細(xì)胞株中，有四環(huán)素誘導(dǎo)的p53表達(dá)，被誘導(dǎo)的p53通過(guò)上調(diào)Fas和恢復(fù)半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)活性，能促進(jìn)吉非替尼誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制和凋亡。相反，同等條件下使用反義寡聚核苷酸的p53抑制劑，在A549細(xì)胞株中能使吉非替尼誘導(dǎo)的凋亡明顯降低，同時(shí)Fas下調(diào)。因此，p53可能通過(guò)調(diào)節(jié)NSCLC中的Fas表達(dá)以確定腫瘤細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性。

綜上所述，分子靶向治療對(duì)腫瘤治療具有劃時(shí)代的意義，從基因?qū)W角度尋找合適的患者，能達(dá)到最好的治療效果。耐藥現(xiàn)象不可避免地發(fā)生為靶向治療進(jìn)一步的應(yīng)用帶來(lái)問(wèn)題，對(duì)于耐藥機(jī)制的研究可以幫助人們尋找到能夠預(yù)測(cè)療效和指導(dǎo)治療策略的分子標(biāo)志物，使得靶向藥物的治療效果進(jìn)一步提高。

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