高效液相色譜法測定家兔血漿中丹參素的含量

梁巖冰，田玉琴

（1.河北大學藥學院，河北 保定071002；2.河北北方學院，河北 張家口075000）

丹參素 ［D （＋）－β－（3，4－二羥基苯基）－乳酸］是活血化淤中藥丹參的主要有效成分之一，具有保護心肌缺血、拮抗動脈粥樣硬化、抗血栓、改善微循環(huán)、保護肝臟、抗菌抗炎、抗腫瘤等作用［1］.藥材中丹參素的含量測定多有報道［2－4］，但丹參素在家兔血漿中的含量測定還未見報道.本實驗建立了以液－液萃取為前處理的高效液相色譜法測定家兔血漿中丹參素的含量，血漿經(jīng)酸化后用乙酸乙酯萃取，效果較好.

1 儀器與試劑

島津2010A高效液相色譜儀，包括SPD－M10AVP紫外檢測器、SIL－10 Advp自動進樣器；YDQ－01 A型氮吹儀 （寧波亞福儀表制造有限公司）；SZ－97 A自動三重水蒸餾器 （上海亞榮生化儀器廠）；Sartorius萬分之一電子分析天平 （塞多利斯科學儀器有限公司）；UV2100紫外可見分光光度計 （深圳市凱銘杰儀器設備有限公司）；丹參素鈉標準品 （99.2%）購于南京澤朗公司；甲醇為色譜純 （上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；實驗用水均為三重蒸餾水.

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：YMC－PACK ODS－A （150 mm×4.6 mm，5μm）；柱溫：40℃；流動相：甲醇—0.5%冰醋酸 （1∶8 v／v）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：281 n m；進樣量：20μL.

2.2 給藥與取血方案

健康家兔6只，實驗前禁食12 h，自由飲水，耳緣靜脈注射20%氨基甲酸乙酯溶液 （5 mg／kg體質(zhì)量）麻醉，按10 mg／kg耳緣靜脈注射丹參素鈉溶液，給藥后經(jīng)頸總動脈取血，收集于肝素化離心管中，4 000 r離心15 min，分離血漿，并于－20℃冷凍保存待測.

2.3 血漿樣品預處理

取肝素抗凝血漿100μL，加0.1 mol／L鹽酸100μL，1 mol／L鹽酸100μL，混勻；加入4 mL醋酸乙酯，渦流混合5 min，離心10 min（3 000 r／min）取上層有機相于另一試管中，40℃水浴氮氣吹干，殘渣加入10%的甲醇溶液1.0 mL，超聲震蕩使其溶解，0.45μm微孔有機系膜濾過，4℃冷藏備用.

2.4 血漿樣品丹參素的含量測定

2.4.1 方法專屬性考察 分別取空白血漿100μL，加生理鹽水100μL，按 “血漿樣品預處理”項下方法操作，按照所選色譜條件測定.空白血漿加適量丹參素鈉對照品溶液，依同法操作，進樣測定，考察方法的專屬性.結果空白血漿加丹參素的色譜圖中5.78 min處有一吸收峰，且與其他色譜峰有較好的分離，見圖1，表明空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾丹參素的測定.

圖1 HPLC圖譜

2.4.2 標準曲線的制備 精密稱取丹參素鈉對照品10.0 mg，用生理鹽水溶解并定容至50 mL，配制成200μg／mL的對照品溶液.分別取空白血漿100μL，依次加入丹參素鈉對照品溶液，配制成含丹參素鈉0.1、0.5、1.0、2.0、10、20、50、100μg／mL血漿樣品，每個質(zhì)量濃度3個樣本，除不加100μL 0.1 mol／L鹽酸外，其他按照 “血漿樣品預處理”項下方法操作，進樣20μL，記錄色譜圖.以丹參素峰面積為縱坐標 （Y）和血漿中丹參素的濃度為橫坐標 （X），進行線性回歸，得到得標準曲線的回歸方程：Y＝158.09X－25.77，r＝0.9999，丹參素濃度在0.1～100μg／mL之間呈良好的線性關系.

2.4.3 精密度試驗 取空白血漿100μL，分別加入丹參素鈉系列對照品溶液，制成含丹參素鈉0.1、10、100μg／mL的血漿，按照 “血漿樣品預處理”項下方法處理，每種濃度重復進樣5次，記錄峰面積，計算精密度，見表1，結果表明所選方法符合中藥生物活性測定指導原則的要求［5］.

表1 丹參素精密度實驗

表2 丹參素穩(wěn)定性實驗

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取空白血漿100μL，分別加入丹參素鈉系列對照品溶液，分別制成含丹參素鈉0.1、10、100μg／mL的血漿，按照“血漿樣品的預處理”項下方法操作，分別在0、1、2、4、6、10、12 h測定，記錄色譜峰面積，見表2，結果表明樣品穩(wěn)定性符合測定要求.

2.4.5 回收率試驗 取空白血漿100μL，分別加入丹參素鈉對照品溶液，配制成含丹參素鈉0.1、10、100μg／mL的血漿各3份，置于具塞離心管中，混勻，按 “標準曲線的繪制”項下方法操作，進樣測定，記錄被測物的峰面積，按測得量和加入量計算方法回收率，平均回收率分別為98.7%、96.8%、101.4%，RSD分別為2.33%、3.01%、2.78%.表明方法回收率符合實驗測定要求.

3 討 論

丹參素為親脂性藥物，在適當?shù)挠袡C溶劑中的溶解度大于在水相中的溶解度，而血樣中含有的大多數(shù)內(nèi)源性干擾物是強極性的水溶性物質(zhì).因而本實驗采用醋酸乙酯進行液－液萃取，在酸性條件下，游離的丹參素容易被醋酸乙酯提取，且回收率高，重現(xiàn)性好，內(nèi)源性雜質(zhì)干擾小.

本實驗應用HPLC測定家兔血漿中丹參素的含量，此法具有靈敏度高，專屬性強，準確，精密度高等優(yōu)點.適用于血漿樣品的快速大量分析.

［1］ 李艷杰，孫玉華.丹參素藥理作用研究進展 ［J］.延邊大學醫(yī)學學報，2006，29（1）：73－75

［2］ 宋金春，唐開勇.通脈口服液的質(zhì)量標準研究 ［J］.中國藥房，2006，17（22）：1 730

［3］ 靳寶峰，張志國，楊松，等.反相高效液相色譜法測定心脈通凍干粉針中丹參素及原兒茶醛 ［J］.藥物分析雜志，2002，22 （6）：477

［4］ 游勇基，程廣強，陳銘輝.丹參注射液中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和丹參酸B的含量 ［J］.藥物分析雜志，2004，24 （1）：7

［5］ 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中國藥典一部 ［S］.北京：人民衛(wèi)生出版社.2010：附錄132