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    中華蜜蜂有王群與無(wú)王群工蜂上顎腺10-HDA含量比較

    2012-01-17 06:37:56吳麗麗黃少康李三妹蔣星宏
    中國(guó)蜂業(yè) 2012年4期
    關(guān)鍵詞:王群上顎工蜂

    吳麗麗 黃少康 李三妹 蔣星宏

    (福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院,福州 350002)

    反式-10-羥基-2-癸烯酸(10-HDA)是工蜂上顎腺的主要分泌物,也是王漿中最主要的不飽和脂肪酸之一[1]。它不僅是王漿的天然保鮮劑,而且是雌性蜜蜂幼蟲(chóng)級(jí)型發(fā)育過(guò)程中重要的調(diào)控因子[2]。由于上顎腺與級(jí)型發(fā)育的關(guān)系,很早就受到研究者的關(guān)注,對(duì)不同蜂種的蜂王、工蜂上顎腺中10-HDA的檢測(cè)已有不少報(bào)道。如,Plettner et al.(1993)對(duì)西方蜜蜂(Apis mellifera)的無(wú)王群采集蜂、有王群工蜂、產(chǎn)卵工蜂等的上顎腺10-HDA進(jìn)行比較,未發(fā)現(xiàn)它們的10-HDA含量上有顯著差異[3]。Plettner (1997)對(duì)5種蜜蜂的蜂王和工蜂上顎腺中包括10-HDA在內(nèi)的多種成分進(jìn)行了檢測(cè),檢測(cè)表明,采自加拿大的西方蜜蜂越冬工蜂10-HDA含量高達(dá)95±15μg,采自馬來(lái)西亞的大蜜蜂(Apis dorsata)采集蜂的含量達(dá)56,從斯里蘭卡Horana采集的東方蜜蜂(A. cerana)外勤工蜂中僅檢測(cè)到0.8±0.2μg/bee,黑小蜜蜂(A.andreniformis)工蜂為3.2±0.5μg/bee,小蜜蜂(A.florea)工蜂為11±1μg/bee。說(shuō)明不同蜂種間工蜂,蜂王及工蜂間上顎腺10-HDA[4]等內(nèi)容物含量存在顯著差異。

    蜂王的存在是蜂群完整性與穩(wěn)定性的標(biāo)志,蜂王上顎腺分泌物具抑制工蜂體內(nèi)咽側(cè)體活性,進(jìn)而延遲工蜂的出巢日齡的作用[5]。有王蜂中,工蜂各項(xiàng)活動(dòng)秩序井然;一旦失王,蜂群生物學(xué)特性以及工蜂腺體分泌物會(huì)發(fā)生顯著性變化,這在海角蜜蜂中表現(xiàn)得尤其明顯,室內(nèi)無(wú)王籠養(yǎng)的海角蜜蜂工蜂上顎腺分泌物會(huì)逐漸向蜂王方向轉(zhuǎn)化,逐漸以9-ODA為主[6]。對(duì)無(wú)王和有王狀態(tài)下小蜜蜂(A.florea)工蜂上顎腺10-HDA的檢測(cè)顯示,無(wú)王群工蜂平均含7.4μg/bee,有王群工蜂平均含10.1μg/bee,兩者之間有顯著差異[7],說(shuō)明蜂王的有無(wú)對(duì)工蜂上顎腺10-HDA有影響。與西方蜜蜂相比,中蜂(A.cerana cerana)是一種對(duì)失王狀態(tài)更為敏感的蜂種,中蜂群失王后,群內(nèi)出現(xiàn)產(chǎn)卵工蜂的時(shí)間常常比西方蜜蜂短,那么,無(wú)王后,中蜂工蜂上顎腺的分泌物是否也會(huì)有所變化?在此,在有無(wú)和無(wú)王狀態(tài)下我們對(duì)中蜂工蜂上顎腺主要的分泌物10-HDA含量進(jìn)行了測(cè)定和比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)王群工蜂10-HDA的含量極顯著高于有王群工蜂,現(xiàn)具體報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 中蜂群

    中蜂由福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院提供,每群群勢(shì)為3~4足框。有王群9群,無(wú)王群7群。無(wú)王群失王1~2周,群內(nèi)無(wú)子、無(wú)工蜂產(chǎn)卵現(xiàn)象。

    1.1.2 主要儀器與試劑

    LC-20A高效液相色譜儀(日本島津)(色譜柱:4.6mm×250mm不銹鋼柱,填充物不定形硅膠C18鍵合相,10μm);SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器(日本株式會(huì)社島津制作所);KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司);流動(dòng)相過(guò)濾裝置(津騰)。有機(jī)濾膜(0.45μm),一次性5ml針筒,10ml容量瓶,玻璃研磨器等。

    甲醇(色譜純,德國(guó)MECK集團(tuán)有限公司);無(wú)水乙醇,磷酸(優(yōu)級(jí)純GR),對(duì)羥基苯甲酸甲酯(分析純,含量99.0%),由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);10-HDA標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.6%,湖北揚(yáng)子江蜂業(yè)公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 取樣

    2010年6月10日,分別在10群中蜂有王群的巢門(mén)口抓取回巢的外勤蜂,每箱抓取工蜂約100只。從失王1~2周的7群無(wú)子、無(wú)王群中,提脾,每群取工蜂約100只以上,于-80℃冷凍保存。

    1.2.2 試液的配置

    (1)10-HDA標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液配制

    稱(chēng)取干燥后的10-HDA標(biāo)準(zhǔn)品0.0305g,用無(wú)水乙醇溶解并移入50ml容量瓶中定容。此溶液每毫升含10-HDA 0.61mg。

    (2)內(nèi)標(biāo)溶液配制

    稱(chēng)取干燥過(guò)的對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.1671g,加無(wú)水乙醇溶解并移入250ml容量瓶中,用無(wú)水乙醇稀釋至刻度,搖勻。此溶液每毫升含對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.6684 mg。

    (3)樣品溶液制備

    剪取同群10只工蜂頭部,放入一研磨器中,加入少量甲醇研磨,用超聲波清洗器超聲5min促使其溶解。把研磨液移入已經(jīng)加入1ml內(nèi)標(biāo)溶液的10毫升容量瓶中。研磨器潤(rùn)洗2~3遍,潤(rùn)洗后的液體也移入容量瓶?jī)?nèi),最后加甲醇定容,超聲40min后靜置過(guò)夜。用0.45μm濾膜過(guò)濾,濾液即為一待測(cè)樣本。每群制備5個(gè)樣本,無(wú)王群與有王群待測(cè)樣本均同法制備。

    1.2.3 色譜方法學(xué)檢測(cè)

    (1)線性關(guān)系考察

    精密量取10-HDA標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0至10.0ml容量瓶中。精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1ml,用無(wú)水乙醇稀釋至刻度,搖勻。分別吸取10μl注入液相色譜儀,210nm測(cè)定。結(jié)果表明,10-HDA進(jìn)樣量(X)在0.122~2.44μg范圍內(nèi)與峰面積(Y)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系?;貧w方程Y=2×10-5X+1.0167,R2=0.9999。

    (2)精密度試驗(yàn)

    自動(dòng)進(jìn)樣10-HDA標(biāo)準(zhǔn)品10μl,重復(fù)進(jìn)樣5次,測(cè)得10-HDA峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.6%(n=5),進(jìn)樣方法和儀器精密度良好。

    (3)穩(wěn)定性試驗(yàn)

    精密吸取中蜂工蜂頭部樣品10μl進(jìn)樣分析,分別于1h、4h、8h、12h、24h時(shí)重復(fù)一次,測(cè)得10-HDA峰面積的RSD為1.2%,表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

    (4)加樣回收率試驗(yàn)

    準(zhǔn)確稱(chēng)取已知10-HDA含量的樣本,分別加入適量的10-HDA標(biāo)準(zhǔn)品,制備樣品溶液,進(jìn)樣10μl,測(cè)得10-HDA的回收率均在95%以上。

    1.2.4 樣品10-HDA含量測(cè)定

    取待測(cè)樣品,按以下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。色譜柱:20RBAX Eclipse XDB-C18,(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇-0.2%磷酸溶液(55:45);流速:1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):210nm;進(jìn)樣量:10μl。

    1.2.5 數(shù)據(jù)分析

    根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)HPLC檢測(cè)所得10-HDA的峰面積換算得到工蜂10-HDA的含量。用SPSS軟件中Levene test進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),對(duì)方差齊性數(shù)據(jù)用one-way ANOVA中的LSD法對(duì)進(jìn)行多重顯著性分析,對(duì)方差不齊的數(shù)據(jù)組用one-way ANOVA中Dunett T3法進(jìn)行多重顯著性分析。用t-test對(duì)無(wú)王群和有王群工蜂10-HDA的含量進(jìn)行差異比較。

    2 結(jié)果與分析

    對(duì)中蜂有王群10群及無(wú)王群7群工蜂上顎腺10-HDA含量的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。有王群中,每只工蜂頭部10-HDA的平均含量為2.75±1.05μg(N=50)。不同蜂群間工蜂上顎腺10-HDA含量方差不齊,存在顯著差異(Levene test,P=0.02<0.05),故采用SPSS中unequal variance ANOVA的Dunett T3進(jìn)行多重顯著性檢驗(yàn),檢驗(yàn)結(jié)果表明,1號(hào)群的10-HDA含量顯著低于4、6、7號(hào)群(p=0.014,0.006,0.02<0.05)。7號(hào)群外勤蜂10-HDA含量。

    平均含量高達(dá)4.76±0.41μg,顯著高于1,2,3群(P=0.02,0.05,0.032≤0.05)。2,3,4,5,8,9,10號(hào)群間無(wú)顯著差異(P>0.05),說(shuō)明多數(shù)有王群間采集蜂的10-HDA含量無(wú)顯著差異,僅個(gè)別蜂群(1和7號(hào)群)含量存在差異。由于我們的樣本未明確日齡,還不能完全排除這種差異由日齡差異引起的可能性。

    無(wú)王群工蜂10-HDA的平均含量為5.47μg(N=35),為有王群工蜂含量的2倍,極顯著高于有王群工蜂(t-test,P=0.000<0.01)。因?yàn)闊o(wú)王群各群間數(shù)據(jù)方差齊性(Levene test,P=0.58>0.05),故采用LSD法進(jìn)行多重顯著性差異比較,結(jié)果顯示,無(wú)王群中1號(hào)群工蜂10HDA平均含量均極顯著高于2至7群(P=0.004,0.000,0.001,0.000,0.000,0.000<0.01),10-HDA平均含量達(dá)8.32μg,其余各群之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

    表1 中蜂有王群和無(wú)王群工蜂10-HDA含量比較

    3 討論

    本試驗(yàn)中所選用的無(wú)王群均為群內(nèi)無(wú)子(卵、幼蟲(chóng)、蛹),且無(wú)工蜂產(chǎn)卵現(xiàn)象,工蜂主要從事花蜜采集;有王群工蜂均為回巢的工蜂,主要從事的也是采集活動(dòng),它們都不需要承擔(dān)育子的工作,上顎腺不需要為承擔(dān)哺育幼蟲(chóng)而提供10-HDA,因此,蜂群對(duì)這些工蜂的功能需求可以認(rèn)為是相近的,即兩種樣本之間的主要差異是有王與無(wú)王的差異。在有王狀態(tài)下,蜂王上顎腺信息素對(duì)工蜂的生理和行為都具有顯著的控制作用,能抑制工蜂上顎腺向蜂王方向轉(zhuǎn)變,因此,我們認(rèn)為,中蜂無(wú)王群工蜂10-HDA平均含量顯著高于有王群工蜂的現(xiàn)象主要與蜂群的無(wú)王狀態(tài)有關(guān),即失無(wú)王狀態(tài)導(dǎo)致中蜂群內(nèi)工蜂的10-HDA含量顯著上升,而這種變化的出現(xiàn),可能是因?yàn)闊o(wú)王群中沒(méi)有了蜂王上顎腺信息素抑制因子的存在,從而對(duì)工蜂咽側(cè)體產(chǎn)生影響,進(jìn)而影響保幼激素(JH)的分泌,再對(duì)上顎腺產(chǎn)生影響的調(diào)控途徑完成。但本試驗(yàn)結(jié)果與小蜜蜂[7]中的報(bào)道現(xiàn)象不同,具體原因尚不清楚。因?yàn)楸敬螞](méi)有對(duì)測(cè)試工蜂的日齡進(jìn)行控制,所以仍有必要進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證,同時(shí),搞清這種變化的內(nèi)部生理機(jī)制有助于揭示10-HDA的調(diào)控機(jī)制。

    [1] 徐響,孫麗萍,董捷. 蜂王漿中脂類(lèi)脂肪酸組成的研究. 2009,30(14):213-214.

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