鄂產(chǎn)竹節(jié)參的HPLC-DAD特征圖譜研究

楊 桃，陳 新，李 龍，許 旭，胡 海，吳江磊，何 舟

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023)

竹節(jié)參 Panax japonicus C.A.Mey.為五加科人參屬多年生草本植物的干燥根莖Rhizoma Panacis Japonici［1］，是我國名貴中藥材中常用藥材之一［2］，在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)方面均具有藥理活性［3］;竹節(jié)參中含有多種化學(xué)成分如糖類、皂苷類、黃酮類、揮發(fā)油類、含氮化合物、無機(jī)鹽等，現(xiàn)代藥理及多種文獻(xiàn)報(bào)道表明其主要活性成分為皂苷類化合物，竹節(jié)參皂苷具有抑制腫瘤，鎮(zhèn)痛抗炎，鎮(zhèn)靜，免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性［4-7］，因此對竹節(jié)參進(jìn)行系統(tǒng)的研究與開發(fā)具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，HPLC指紋圖譜在中藥材制劑質(zhì)量控制方面的運(yùn)用逐漸受到多方重視，但指紋圖譜的建立通常是以1種或幾種指標(biāo)成分作為對照為基礎(chǔ)的，并沒有對復(fù)雜多樣的中藥化學(xué)成分之間可能存在的協(xié)同作用進(jìn)行考慮。因此，全息圖譜逐漸被引入中藥材的質(zhì)量控制之中［8-9］。本文根據(jù)竹節(jié)參中總皂苷類化合物的化學(xué)性質(zhì)，確定該類化合物的提取方法，并結(jié)合TLC、UV及HPLC全息圖譜，對竹節(jié)參總皂苷定性分析，對該化合物進(jìn)行指認(rèn)，并為竹節(jié)參指紋圖譜的建立提供一個(gè)很好的補(bǔ)充。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

竹節(jié)參(購于亳州藥材市場)。

1.1.2 試劑試藥

無水乙醇(分析純)、超純水、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純);竹節(jié)參皂苷Ⅳa、楤木皂苷A、竹節(jié)參皂苷Ⅰb、竹節(jié)參皂苷ⅴ(前期試驗(yàn)中制得，純度＞98%，經(jīng)核磁檢測并鑒定其結(jié)構(gòu))

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260分析型單元液相色譜儀(美國安捷倫公司)，DAD檢測器(G1315D 1260 DAD VL)，柱溫箱(G1316A 1260 TCC);Molresearch1010A超純水器-摩爾分析型超純水器(重慶摩爾水處理有限公司);Ar2140型電子天平(沈陽龍騰電子有限公司;SB-5200雙頻超聲清洗機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司);BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)。

1.3 樣品溶液的配制及色譜條件

1.3.1 竹節(jié)參皂苷提取物的制備

取干燥的竹節(jié)參粗粉1g，精密稱定，置250 mL圓底燒瓶中，加入70%乙醇溶液100 mL，設(shè)定水浴溫度80℃加熱回流，回流提取3h，共提取三次，合并三次提取的濾液并濃縮，用70%乙醇定容于100 mL容量瓶中，得濃度為10mg原料/mL的供試品液，用0.45μm的微孔濾膜過濾，作為竹節(jié)參總皂苷提取物的供試品溶液，待測定。

1.3.2 液相色譜條件

色譜柱：Apollo C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);檢測波長：203 nm;柱溫：30 ℃;流速：1 mL· min-1;進(jìn)樣量：20 μL;流動相：流動相A(0.05%磷酸水溶液)與流動相B(乙腈)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫比例如表1。

表1 梯度洗脫流動相

1.3.3 TLC展開條件

取少量濃縮后的提取物于EP管中，加適量甲醇稀釋，點(diǎn)樣于硅膠G板上，置于展開條件為氯仿∶甲醇∶甲酸(2∶1∶5‰)的展開缸中，展開后噴以10%硫酸乙醇溶液顯色，觀察硅膠板上的斑點(diǎn)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹節(jié)參皂苷提取物的TLC圖譜

用硫酸試劑顯色后的硅膠板如圖1所示，板上呈現(xiàn)清晰的紅色斑點(diǎn)，根據(jù)皂苷類物質(zhì)的顯色特征，可以初步判定為皂苷類化合物。

圖1 竹節(jié)參總皂苷提取物TLC圖

圖1中原點(diǎn)為竹節(jié)參總皂苷提取液濃縮后樣品，1—4分別為竹節(jié)參皂苷Ⅳa，楤木皂苷A，竹節(jié)參皂苷Ⅰb、竹節(jié)參皂苷ⅴ對照品，通過原液與對照品的Rf值大小的比對，及原液與對照品顏色的相似程度可以初步判斷原液中含有該四種竹節(jié)參皂苷成分。該薄層色譜的展開條件是根據(jù)皂苷類化合物的性質(zhì)通過多次實(shí)驗(yàn)摸索篩選優(yōu)化而來。在展開劑中加入少量醋酸，是為了防止酸性皂苷產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象。本文所用方法制備總皂苷提取物，簡便易行。所用展開方式，快捷并且展開效果較好。

2.2 總皂苷提取物的HPLC—DAD圖譜

根據(jù)《中國藥典2010版一部》［10］，竹節(jié)參皂苷的HPLC檢測波長為203 nm，在此波長條件下按照1.3.2色譜條件進(jìn)樣，樣品的HPLC圖譜見圖2。

圖2 竹節(jié)參皂苷提取物高效液相圖譜

圖3 竹節(jié)參皂苷全局三維圖譜

分析圖2可以看出，有部分物質(zhì)由于濃度較小，在此圖上呈現(xiàn)出小峰。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［11］，四個(gè)峰面積最大的峰即1，2，3，4號峰為竹節(jié)參皂苷的主要成分。圖3為竹節(jié)參皂苷的全局三維圖譜，它采用光電二極管陣列作為檢測元件，構(gòu)成多通道并行工作，同時(shí)檢測由光柵分光，再入射到陣列式接收器上的全部波長的光信號，然后對二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到吸收值(A)是保留時(shí)間(tR)和波長(l)函數(shù)的三維色譜光譜圖。由此可及時(shí)觀察每一個(gè)竹節(jié)參皂苷組分的色譜圖相應(yīng)的光譜數(shù)據(jù)，從而迅速獲得竹節(jié)參皂苷的紫外信息。

圖2中標(biāo)注的竹節(jié)參皂苷色譜峰對應(yīng)的UV光譜圖如圖4所示。紫外分光光度法測定的是總皂苷，由于竹節(jié)參中皂苷大多為齊墩果烷型［12］，該類型的皂苷在波長為200 nm—400 nm處紫外吸收不明顯，只有末端吸收，圖4中1—4號峰的保留時(shí)間與該類型皂苷的紫外光譜一致，所以在利用UV測定時(shí)，在該波長范圍內(nèi)無明顯紫外吸收的特征即可作為鑒定竹節(jié)參皂苷的依據(jù)。

圖4 竹節(jié)參皂苷提取物的UV光圖

3 結(jié)論

竹節(jié)參總皂苷具有抗炎鎮(zhèn)痛及抗疲勞等活性，雖然竹節(jié)參皂苷種類繁多，除四種主要成分以外，其它皂苷的含量并不高。HPLC-DAD可對竹節(jié)參總皂苷成分進(jìn)行有效地分離，同時(shí)可對皂苷主要成分色譜峰的紫外特征譜初步定性。目前，對皂苷類化合物的全息三維圖譜分析還鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，本論文結(jié)合TLC、UV及三維圖譜法同時(shí)對竹節(jié)參藥材進(jìn)行鑒定，方法簡便、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)，并且該法對竹節(jié)參總皂苷指紋圖譜的建立是一個(gè)很好的補(bǔ)充。在中藥化學(xué)成分的分析中，多波長指紋圖譜適應(yīng)復(fù)雜性的科學(xué)要求，實(shí)質(zhì)是從多維信息角度揭示指紋圖譜代表的整體化學(xué)指紋系統(tǒng)的全信息，它較單波長指紋圖譜更能全面地反映中藥的化學(xué)物質(zhì)信息。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：129-129.

［2］ 中國藥科大學(xué)，中國醫(yī)藥科技出版社.中藥辭海(第1卷)［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1993：2122.

［3］ 林先明，由金文，劉海華，等.竹節(jié)參開花結(jié)果習(xí)性觀察［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，45(3)：347-348.

［4］ 吳錦忠，易駿，林小峰，等.人參屬四種植物中氨基酸和無機(jī)元素的比較研究［J］.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1992：17(3)：230.

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［7］ 陳永波，饒斌.竹節(jié)人參中氨基酸和皂苷特征組分的分析鑒別［J］.色譜，2003：248-250.

［8］ 孫國祥，吳波，畢開順.平行五波長高效液相色譜指紋圖譜全息整合法定量鑒定杞菊地黃丸的整體質(zhì)量［J］.色譜，2010，28(9)：877-884.

［9］ 李萍，薛粲.試論中藥材全息圖譜質(zhì)量評測人工智能系統(tǒng)構(gòu)建［J］.世界科學(xué)技術(shù)—中藥現(xiàn)代化，2001，3(4)

［10］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：7-7.

［11］ Rufeng Wang，Ping Chen，F(xiàn)ang Jia，et al.Optimization of polysaccharides from Panax japonicus C.A.Meyer by RSM and its antioxidant activity［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2012，50，331-336.(SCI)

［12］ 陳永波，饒斌，沈艷芬，等.竹節(jié)人參中氨基酸和皂苷特征組分的分析鑒別［J］.色譜，2003(3).