加強(qiáng)形態(tài)學(xué)檢查提高細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性

陳東科

(衛(wèi)生部北京醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京100730)

加強(qiáng)形態(tài)學(xué)檢查提高細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性

陳東科

(衛(wèi)生部北京醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京100730)

細(xì)菌形態(tài)學(xué)的檢查是最基本、最簡單、最快速、最直觀、最經(jīng)濟(jì)的常規(guī)鑒定方法,對鑒定細(xì)菌有“導(dǎo)航”的作用。細(xì)菌形態(tài)學(xué)包括細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)菌菌落形態(tài)學(xué)，正確的形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果是準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌的堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)人員必須掌握一定的形態(tài)學(xué)知識(shí)，這也是基本的從業(yè)要求。

細(xì)菌；形態(tài)學(xué)檢查；鑒定

隨著自動(dòng)化細(xì)菌鑒定儀器的普及使用，細(xì)菌鑒定越來越規(guī)范，鑒定準(zhǔn)確性有了很大的提高。但全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀也不是萬能的，那些代謝慢、生化反應(yīng)弱的細(xì)菌很難得以準(zhǔn)確鑒定。有些實(shí)驗(yàn)室由于過分依賴自動(dòng)化鑒定儀，對基本的形態(tài)學(xué)特征、染色特性及鑒別性試驗(yàn)(如觸酶、凝固酶、氧化酶等試驗(yàn))盡量少做或不做，以至于選錯(cuò)鑒定試卡。其結(jié)果有兩種情況：一是不能鑒定，二是錯(cuò)誤的鑒定結(jié)果，后一種情況很難被發(fā)現(xiàn)，較前一種結(jié)果更具危害性。如何避免上述狀況的發(fā)生，以及提高對少見菌和疑難菌鑒定的準(zhǔn)確性，這就需要我們臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)人員加強(qiáng)專業(yè)修養(yǎng)，提高業(yè)務(wù)水平，掌握包括形態(tài)學(xué)等基礎(chǔ)的微生物學(xué)知識(shí)。

眾所周知，鑒定細(xì)菌的原則之一就是用最少的試驗(yàn)完成鑒定。細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查就是最基本、最簡單、最快速、最直觀、最經(jīng)濟(jì)的常規(guī)鑒定方法，也是確認(rèn)分離菌株的參考方法之一[1-5]。對細(xì)菌形態(tài)學(xué)的正確描述依賴于方法、培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間、染色試劑、操作技巧等[6]。細(xì)菌形態(tài)學(xué)包括細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)菌菌落形態(tài)學(xué)[7]。

1 細(xì)菌的菌落特征

細(xì)菌在固體培養(yǎng)基表面生長形成菌落。對菌落進(jìn)行描述應(yīng)包括菌落大小(分大、中、小，以1mm為界)、形狀、高度、邊緣、表面狀態(tài)、密度(透明度)、硬度 (用接種環(huán)刮取菌落時(shí)的感覺)、菌落內(nèi)部結(jié)構(gòu)、顏色、光澤以及與培養(yǎng)基表面的黏附程度，還應(yīng)包括菌落的溶血、氣味和色素產(chǎn)生情況等特性。觀察細(xì)菌的典型形態(tài)，應(yīng)該是將細(xì)菌接種在該細(xì)菌最適生長的培養(yǎng)基上、放入該細(xì)菌最適生長環(huán)境中(包括溫度和所需氣體條件)進(jìn)行孵育，孵育時(shí)間應(yīng)視細(xì)菌的生長速度而定，大部分常見的細(xì)菌以培養(yǎng)24h為宜，有些細(xì)菌需要更長時(shí)間的孵育才能顯現(xiàn)出典型的菌落特征。有時(shí)為了鑒別某一種或某一類細(xì)菌，需要觀察細(xì)菌在特殊的培養(yǎng)基(包括顯色培養(yǎng)基)上或在特定環(huán)境下(氣體、溫度和光線等)培養(yǎng)的形態(tài)特征。觀察菌落特征的目的是為了對細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定。有些特征是某些細(xì)菌所特有的，具有屬或種的鑒別價(jià)值，如肺炎鏈球菌在綿羊血瓊脂平板上的臍窩樣菌落(見封三圖1所示)、伴放線凝集桿菌菌落特殊的內(nèi)部結(jié)構(gòu)(見封三圖2所示)、侵蝕艾肯菌的斗笠樣菌落、斯氏假單胞菌(及黃色單胞菌和金色單胞菌)的皺紋樣菌落、變形桿菌遷徙樣菌落、嗜麥芽窄食單胞菌的“貓眼”菌落、銅綠假單胞菌的水溶性色素、紫色色桿菌的脂溶性色素(見封三圖3所示)、沙雷菌的紅色色素(見封三圖4所示)、產(chǎn)吲哚金黃桿菌產(chǎn)生的吲哚氣味、嗜血桿菌產(chǎn)生的鼠穴氣味、諾卡菌產(chǎn)生的腐土氣味、厭氧菌產(chǎn)生的腐氨氣味、熒光假單胞菌產(chǎn)生的黃色熒光素、某些厭氧菌可產(chǎn)生磚紅色熒光素等。有些細(xì)菌產(chǎn)生色素受到氣體的影響(粘質(zhì)沙雷菌在厭氧環(huán)境下不產(chǎn)色)，有些細(xì)菌產(chǎn)生色素受到光線的影響(某些快速生長分枝桿菌是光產(chǎn)色或暗產(chǎn)色)。對細(xì)菌菌落特征的觀察、描述和計(jì)數(shù)是細(xì)菌鑒定的第一步驟，其主要目的體現(xiàn)在以下幾方面。

1.1 對病原菌的定量或半定量分析 在對標(biāo)本進(jìn)行定量或半定量接種后，通過菌落計(jì)數(shù)可獲得定量或半定量結(jié)果，細(xì)菌的定量在尿液分析和療效動(dòng)態(tài)觀察中具有臨床意義，半定量適用于開放性標(biāo)本的結(jié)果分析(確定優(yōu)勢菌)。

1.2 病原菌的確定 開放性標(biāo)本受炎癥組織周圍皮膚、黏膜的常居菌叢污染的可能性較大，觀察培養(yǎng)結(jié)果時(shí)應(yīng)根據(jù)標(biāo)本直接涂片鏡檢結(jié)果，結(jié)合菌落形態(tài)特征來確定病原菌。

1.3 血培養(yǎng)結(jié)果解釋 分析陽性血培養(yǎng)瓶的轉(zhuǎn)種結(jié)果時(shí)，應(yīng)結(jié)合對陽性培養(yǎng)液直接涂片的鏡檢結(jié)果，如果涂片結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果不符，應(yīng)考慮操作錯(cuò)誤或是污染所致。

1.4 確定鑒定方向 根據(jù)不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征，結(jié)合革蘭染色鏡檢結(jié)果及快速輔助試驗(yàn)(氧化酶、觸酶、凝固酶等)結(jié)果，可做初步判定，并確定后續(xù)鑒定方向。

2 細(xì)菌的菌體形態(tài)特征

臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室仍然使用細(xì)胞形態(tài)學(xué)的方法進(jìn)行細(xì)菌鑒定，革蘭染色細(xì)胞形態(tài)學(xué)是細(xì)菌分類學(xué)的基礎(chǔ)。掌握細(xì)胞形態(tài)學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法能夠?yàn)闇?zhǔn)確鑒定細(xì)菌提供可靠保證。很難想象革蘭染色的錯(cuò)誤會(huì)導(dǎo)致正確的鑒定結(jié)果。對細(xì)菌菌體形態(tài)特征的觀察和描述是細(xì)菌鑒定的第二步驟，其主要目的體現(xiàn)在以下幾方面。

2.1 可解釋培養(yǎng)結(jié)果、確定鑒定方向 無論是液體培養(yǎng)(如血培養(yǎng)、標(biāo)本直接增菌培養(yǎng))或是固體培養(yǎng)(接種培養(yǎng)皿)，都應(yīng)該將培養(yǎng)物進(jìn)行涂片、染色鏡檢確定培養(yǎng)物的性質(zhì)，既可快速報(bào)告，也是為下一步的鑒定指明方向。圖5(見封三)所示為血培養(yǎng)陽性培養(yǎng)物涂片革蘭染色鏡檢結(jié)果，形態(tài)學(xué)需區(qū)分諾卡菌與放線菌，經(jīng)改良抗酸染色結(jié)果為陽性(見封三圖6所示)，可確定該菌是諾卡菌屬某種。

2.2 是鑒別細(xì)菌的手段 細(xì)菌菌體形態(tài)結(jié)合菌落形態(tài)特征可對細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定。例如，在選擇性巧克力平板(加萬古霉素)上生長的草綠色溶血菌落，是乳桿菌還是腸球菌(VRE)只要涂片鏡檢就很容易區(qū)分；鮑曼不動(dòng)桿與克雷伯菌屬細(xì)菌的菌落形態(tài)相似，鏡下區(qū)別前者為革蘭陰性球桿菌(接近球菌)，后者為革蘭陰性桿菌；丹毒絲菌在血平板上的菌落形態(tài)與草綠色鏈球菌很相像，但鏡下形態(tài)差別很大。圖7(見封三)所示為紅斑丹毒絲菌的革蘭染色鏡下形態(tài)。

2.3 是鑒定方向及試劑選擇的依據(jù) 葡萄球菌和鏈球菌、革蘭陽性球菌和革蘭陽性桿菌、芽孢桿菌和非芽孢桿菌、革蘭陰性球菌和革蘭陰性桿菌的鑒定方向完全不同，試劑選擇也不同，如果選錯(cuò)試劑結(jié)果必然是錯(cuò)誤的，有些錯(cuò)誤的結(jié)果很難被發(fā)現(xiàn)，最終導(dǎo)致臨床治療的失敗。

2.4 是藥敏組合選擇的依據(jù) CLSI文件規(guī)定，每一種細(xì)菌都有一定的抗菌藥物組合供選擇。要準(zhǔn)確進(jìn)行藥敏組合選擇，就必須有準(zhǔn)確的細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果作支持。如果把球菌和桿菌、革蘭陰性和革蘭陽性細(xì)菌混淆了，最終結(jié)果將會(huì)出現(xiàn)偏差，報(bào)告臨床的后果不堪設(shè)想。

3 菌體特殊結(jié)構(gòu)的觀察

3.1 莢膜 莢膜是某些細(xì)菌在細(xì)胞壁外包裹的一層粘液性物質(zhì)，一般由多糖和多肽組成。莢膜作為細(xì)菌的毒力因子有必要對其染色觀察，莢膜腫脹試驗(yàn)可特異性的鑒定細(xì)菌。

3.2 鞭毛 鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官，觀察細(xì)菌鞭毛對于細(xì)菌鑒定有十分重要的意義。依據(jù)鞭毛的有無、位置和數(shù)量，細(xì)菌分為無鞭毛菌、單端極鞭毛菌、單端雙鞭毛菌、單端叢鞭毛菌、周鞭毛菌、側(cè)鞭毛菌等。臨床實(shí)驗(yàn)室可用動(dòng)力試驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)菌鞭毛的存在，但動(dòng)力試驗(yàn)無法代替鞭毛染色在細(xì)菌鑒定中的地位。

3.3 芽孢 芽孢是芽孢桿菌休眠期的一種特殊形態(tài)。芽孢的形態(tài)包括芽孢形狀、芽孢位置和孢子囊膨大。芽孢形態(tài)分為圓柱形、橢圓形、球形，芽孢位置分為端生、近端生、中生或近中生。根據(jù)芽孢的形態(tài)學(xué)可以對芽孢桿菌屬和梭菌屬進(jìn)行初步鑒定。芽孢桿菌的鑒定有專用的試劑，不可與其他細(xì)菌的鑒定試劑混用。觀察芽孢的方法很多，有染色法和直接觀察法。但芽孢染色并不優(yōu)于革蘭染色，使用相差顯微鏡觀察芽孢優(yōu)于芽孢染色和革蘭染色。圖8(見封三)所示為艱難梭菌芽孢染色結(jié)果。

3.4 異染顆粒 異染顆粒其主要成分是多聚偏磷酸鹽，可隨菌齡的延長而變大。多聚磷酸鹽顆粒對某些染料有特殊反應(yīng)，產(chǎn)生與所用染料不同的顏色，因而得名異染顆粒。如用甲苯胺藍(lán)、次甲基藍(lán)染色后不呈藍(lán)色而呈紫紅色。棒狀桿菌和某些芽孢桿菌常含有這種異染顆粒。常見于白喉棒狀桿菌，位于菌體兩端，故又稱極體，有助于該菌的鑒定。

4 細(xì)菌形態(tài)學(xué)是微生物實(shí)驗(yàn)室報(bào)告審核的重要依據(jù)

對檢驗(yàn)結(jié)果的審核是臨床微生物實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)流程的最后一道工序，應(yīng)該由技術(shù)全面的技術(shù)人員進(jìn)行把關(guān)。審核報(bào)告應(yīng)該從檢驗(yàn)申請單、感染部位選擇、標(biāo)本的采集與處理、標(biāo)本直接涂片鏡檢結(jié)果的描述、標(biāo)本的接種和孵育、菌落形態(tài)觀察和描述、菌落涂片鏡檢結(jié)果描述、附加試驗(yàn)的選擇及結(jié)果判斷、免疫學(xué)試驗(yàn)結(jié)果分析、生化試劑的選擇與結(jié)果觀察記錄、專家系統(tǒng)提示內(nèi)容解讀、抗菌藥物組合的選擇和結(jié)果分析、以及室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果等全過程進(jìn)行綜合分析，必要時(shí)還應(yīng)征求臨床醫(yī)生對疾病診斷的意見，了解患者病情及用藥的相關(guān)信息。最終鑒定結(jié)果須與形態(tài)學(xué)結(jié)果相符，如果出現(xiàn)不符合結(jié)果，尤其在藥敏試驗(yàn)結(jié)果與鑒定結(jié)果相矛盾時(shí)(既無法解釋的耐藥機(jī)制)，首先應(yīng)審核鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)結(jié)果是否相符，如果結(jié)果不相符，應(yīng)該審核整個(gè)檢驗(yàn)過程，找到問題所在，并重新進(jìn)入鑒定程序。

綜上所述,細(xì)菌形態(tài)學(xué)的檢查,對鑒定細(xì)菌有“導(dǎo)航”的作用，正確的形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果是準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌的堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。這就要求每一位從事臨床微生物檢驗(yàn)的技術(shù)人員必須掌握一定的形態(tài)學(xué)知識(shí)，并在實(shí)際工作中不斷學(xué)習(xí)、總結(jié)提高，早日成為一名優(yōu)秀的臨床微生物檢驗(yàn)工作者，為臨床治療感染性疾病提供優(yōu)質(zhì)服務(wù)。

[1]Murray PR.Manual of clinical microbiology[M].10th ed.Washhington DC:American Society for Microbiology Press,2011:3-209.

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圖1 肺炎鏈球菌

圖2 伴放線凝集桿菌(透射光×4)

圖3 紫色色桿菌

圖4 深紅沙雷菌

圖5 血培養(yǎng)-諾卡菌(革蘭染色×1000)

圖6 血培養(yǎng)-諾卡菌(改良抗酸染色×1000)

圖7 紅斑丹毒絲菌(革蘭染色×1000)

圖8 艱難梭菌(孔雀綠染色×1000)

Improvement of the bacterium identification accuracy by morphological examination

CHEN Dongke.Department of Clinical Laboratory,Beijing Hospital of the Ministry of Health,Beijing 100730,China

The bacterial morphology examination,including bacterial cell morphology and bacterial colony morphology,is a routine method for bacteria identification with simple,fast,observable,and economic characteristics and plays a"navigation"role in bacterial identification.Accurate bacterial morphology examination results are the basis for identification of bacteria correctly.Clinical microbiological technicians need to have some bacterial morphology examination knowledge to improve the accuracy of bacterial identification.

Bacteria;Morphological examination;Identification

R446.5

A

1674-1129(2012)05-0419-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.05.001

陳東科，1961年5月生，男，副主任檢驗(yàn)師，主要從事病原微生物形態(tài)學(xué)、疑難菌鑒定、抗生素藥效學(xué)研究。