L-蛋氨酸及甲醇濃度對畢赤酵母搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)S-腺苷蛋氨酸的影響

許海琴，倪輝，2，3，蔡慧農(nóng)，2，3，楊秋明，2，3，伍菱，2，3，肖安風(fēng)，2，3*

(1.集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建廈門361021;2.福建省高校食品微生物與酶工程研究中心，福建廈門361021;3.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建廈門361021)

S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)是生物體內(nèi)一種重要的中間代謝物質(zhì)，它參與生物體內(nèi)眾多重要的生化反應(yīng)，具有廣泛的治療和保健作用，如可以治療關(guān)節(jié)炎、抑郁癥、肝功能紊亂、胰腺炎等［1］，并且可以預(yù)防腫瘤、心血管疾病和抗衰老［2-3］。SAM 的合成方法主要有化學(xué)(CH3I)合成，因反應(yīng)底物價格昂貴、產(chǎn)率低、產(chǎn)物為消旋體等缺點，而未能生產(chǎn)應(yīng)用;體外酶促轉(zhuǎn)化法利用SAM合成酶催化底物L(fēng)-蛋氨酸和ATP生產(chǎn)(-)型SAM，由于ATP成本太高，因此主要用于生物體內(nèi)SAM代謝的研究;利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)SAM是應(yīng)用最廣泛，成本最低廉的方法，用于生產(chǎn)SAM的微生物有酵母［4］、細菌［5］、霉菌［6］等。2008年，Zhang等［6］利用Streptomyces actuosus過量表達SAM合成酶，從而提高了SAM和納西肽的產(chǎn)量。2006年，陶敏等［5］從大腸埃希菌BL21(DE3)中擴增出S-腺苷蛋氨酸合成酶基因，并插入大腸埃希菌高表達載體中表達，酶活達到4.17 μmol/(h·mL)。2008年，王杰鵬等［7］利用經(jīng)常規(guī)誘變處理的SAM優(yōu)勢積累菌株釀酒酵母SAM0801，在5 L發(fā)酵罐上通過對L-蛋氨酸補加策略研究，最終確定L-蛋氨酸的加入時間為30 h，補加量為40 g/L，SAM最高產(chǎn)量為14.4 g/L。2002年，李東陽等［8］首次將釀酒酵母SAM2基因整合至畢赤酵母，優(yōu)化其試管發(fā)酵條件后，SAM產(chǎn)量達到1.72 g/L。2006年，朱志鋼等［9］優(yōu)化了產(chǎn)SAM的重組甲醇型畢赤酵母的培養(yǎng)基，使SAM產(chǎn)量達1.70 g/L，L-蛋氨酸轉(zhuǎn)化率達40.65%。2008年，Zhang等［10］優(yōu)化了搖瓶發(fā)酵中甲醇的添加比例，當(dāng)甲醇添加量為2.0%時，SAM產(chǎn)量最大，達到1.29 g/L。甲醇是影響畢赤酵母表達外源蛋白的一個重要因素，發(fā)酵過程甲醇濃度的測定方法主要有氣相色譜法［11］、FT-MIRS［12］、變色酸分光光度法［13］。氣相色譜法及FT-MIRS對儀器設(shè)備的要求較高且操作復(fù)雜，而變色酸分光光度法不利于實時控制發(fā)酵過程甲醇濃度。本文利用自制甲醇傳感器測定發(fā)酵液中的甲醇濃度，該方法樣品處理簡便、測定快速更適于對發(fā)酵過程甲醇濃度的控制。通過對發(fā)酵過程甲醇的控制以最大限度的提高SAM產(chǎn)量;L-蛋氨酸作為SAM的合成前體對SAM的生產(chǎn)具有較大的影響，因此本實驗通過考察L-蛋氨酸不同添加量對搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)SAM的影響，選擇適于SAM積累的L-蛋氨酸濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種產(chǎn)SAM畢赤酵母菌JMU0907，集美大學(xué)生物工程學(xué)院發(fā)酵工程研究室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基:YPD培養(yǎng)基;搖瓶合成培養(yǎng)基:BMGY培養(yǎng)基［9］。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法①種子培養(yǎng):YPD培養(yǎng)基，28℃，250 r/min，培養(yǎng)12 h;②初始培養(yǎng)條件［14］:將培養(yǎng)好的種子按10%接種量接種至搖瓶合成培養(yǎng)基，在28℃，250 r/min，蛋氨酸7.5 g/L培養(yǎng)24 h后，每24 h添加1%甲醇(體積比)，并取樣分析。誘導(dǎo)120 h后結(jié)束發(fā)酵。

1.2.2 分析方法①生物量的測定:菌液稀釋后于波長600 nm處以蒸餾水為對照進行光度測定，OD600=讀數(shù)×稀釋倍數(shù);②L-蛋氨酸的測定:發(fā)酵液3 500 r/min離心15 min，取上清液用超純水稀釋10倍后，13 000 r/min離心15 min，HPLC測定發(fā)酵液中L-蛋氨酸的含量(色譜條件:100%超純水，210 nm，0.5 mL/min，30℃，C184.6×150 mm，5 μm);③SAM的測定［15］:1 mL發(fā)酵液加入2 mL 1.5 mol/L高氯酸，反應(yīng)2 h，加入2 mL 1.25 mol/L氨。HPLC測定發(fā)酵液中SAM的含量(色譜條件:10 mmol/L甲酸銨，pH 3.0，254 nm，0.5 mL/min，30℃，C184.6×150 mm，5 μm);④甲醇濃度的測定:取1 mL發(fā)酵液以蒸餾水稀釋10倍后用甲醇傳感器測定發(fā)酵液中的甲醇濃度(甲醇傳感器為集美大學(xué)生物工程學(xué)院自制)。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始培養(yǎng)條件下?lián)u瓶實驗結(jié)果

按1.2.1②的初始培養(yǎng)條件，搖瓶培養(yǎng)畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)SAM。發(fā)酵過程甲醇濃度、SAM產(chǎn)量及L-蛋氨酸濃度的變化如圖1所示。

分析發(fā)酵過程L-蛋氨酸濃度的變化，當(dāng)發(fā)酵時間達到96 h時，發(fā)酵液中L-蛋氨酸殘余2.7 g/L。結(jié)束時，發(fā)酵液中L-蛋氨酸濃度為3.1 g/L，因菌體生長及作為前體合成SAM消耗的L-蛋氨酸為4.4 g/L。在該條件下畢赤酵母搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)SAM沒有將7.5 g/L的L-蛋氨酸完全利用，因此，在后續(xù)實驗中對添加至培養(yǎng)基中的L-蛋氨酸的濃度進行考察，以得到適宜的L-蛋氨酸添加量。

在初始的培養(yǎng)條件下，每隔24 h補加1%(體積比)的甲醇，利用甲醇傳感器對發(fā)酵過程的甲醇濃度進行檢測，可以發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵過程的進行，發(fā)酵液中的甲醇濃度不斷增大，當(dāng)發(fā)酵結(jié)束時，發(fā)酵液中的甲醇濃度達到70 g/L。對圖中的SAM含量變化曲線與甲醇濃度的變化曲線進行比較，可以看出，在發(fā)酵的中期(48～96 h)，SAM含量呈現(xiàn)快速增長的趨勢，在發(fā)酵早期和后期，SAM含量變化不明顯。分別計算發(fā)酵過程不同時間段的SAM生產(chǎn)速率，結(jié)果見表1。

圖1 畢赤酵母搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)SAM發(fā)酵曲線Fig.1 Time course for the production of SAM by P.pastoris transformant in shake flasks

表1 誘導(dǎo)發(fā)酵開始后不同時間下甲醇的消耗速率及SAM生產(chǎn)速率Table 1 Methanol consumption and SAM production rate in different period after induced

由表1可見，隨著甲醇濃度的增加，SAM生產(chǎn)速率先呈現(xiàn)上升趨勢:在甲醇誘導(dǎo)的起始階段(24～48 h)，SAM的生產(chǎn)速率很低，此時的甲醇濃度也處于較低的濃度;在48～72 h期間，SAM的生產(chǎn)速率達到0.008 g/(L·h)，相應(yīng)的甲醇濃度為10.9～13.3 g/L;72～96 h期間SAM的生產(chǎn)速率最大，此時的甲醇濃度達到20 g/L左右。當(dāng)甲醇濃度達到40 g/L左右時，SAM的生產(chǎn)速率出現(xiàn)明顯的下降，96～120 h的SAM生產(chǎn)速率為0.004 g/(L·h);而發(fā)酵至120 h，SAM的生產(chǎn)速率接近0，此時的甲醇濃度增至70 g/L以上。這說明低甲醇濃度或高甲醇濃度均不利于SAM的生產(chǎn)，因此，有必要對發(fā)酵過程的甲醇濃度進行考察并優(yōu)化。

2.2 L-蛋氨酸添加量對畢赤酵母搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)SAM的影響

L-蛋氨酸既是SAM合成的前體物質(zhì)，同時還作為碳源、氮源、硫源等參與細胞內(nèi)的其他代謝［16］，因此培養(yǎng)基中的L-蛋氨酸對畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)SAM有著多重的影響。通過添加不同量L-蛋氨酸，考察其對畢赤酵母搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)SAM的影響。圖2、圖3為不同L-蛋氨酸添加量下畢赤酵母發(fā)酵過程的生物量及SAM發(fā)酵曲線。

分析圖2中生物量變化曲線，細胞在以甘油為碳源的生長階段細胞快速生長，且細胞的生長速率與L-蛋氨酸添加量呈反比例關(guān)系。這主要是因為L-蛋氨酸會抑制TCA及EMP途徑，從而減少ATP的產(chǎn)生［17］。因此，在培養(yǎng)基中添加L-蛋氨酸會導(dǎo)致細胞的生長受到影響，L-蛋氨酸添加濃度越高，所獲得的生物量越低。

圖2 發(fā)酵過程不同L-蛋氨酸添加量對畢赤酵母生長的影響Fig.2 Time course of cell growth in P.pastoris fermentation with shake flasks

測定不同L-蛋氨酸添加量下畢赤酵母搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)SAM的變化，結(jié)果如圖3所示。在不添加L-蛋氨酸的菌體中仍然有較低的SAM存在，這是因為畢赤酵母本身會產(chǎn)生少量的SAM參與細胞內(nèi)的反應(yīng);根據(jù)圖1可知2.5 g/L L-蛋氨酸條件下發(fā)酵至96 h時發(fā)酵液中的L-蛋氨酸基本耗盡;而在生物體內(nèi)SAM的合成與分解是一個動態(tài)過程，L-蛋氨酸與ATP結(jié)合生成SAM，SAM又會經(jīng)過多步反應(yīng)最后形成L-蛋氨酸。因此，低濃度的L-蛋氨酸使得SAM的合成速率小于分解速率，菌體內(nèi)的SAM含量下降［16］;5 g/L和7.5 g/L L-蛋氨酸條件下，在整個發(fā)酵過程都能夠提供足夠的L-蛋氨酸供細胞生長及SAM合成需要，因此在該濃度下SAM產(chǎn)量達到一個較高的水平;Thomas等［18］報道，發(fā)酵培養(yǎng)基中L-蛋氨酸的存在會抑制SAM合成酶的轉(zhuǎn)錄，因此，添加10 g/L L-蛋氨酸獲得的SAM產(chǎn)量比添加5 g/L和7.5 g/L L-蛋氨酸的SAM產(chǎn)量低了50%左右。

圖3 添加不同L-蛋氨酸濃度下發(fā)酵過程SAM的變化Fig.3 Time course for the expression of SAM by P.pastoris transform ant in shake flasks

綜合以上實驗結(jié)果，對L-蛋氨酸濃度及發(fā)酵過程SAM最高濃度作圖進行比較，結(jié)果見圖4。由圖4可見，隨著L-蛋氨酸濃度的增大，SAM產(chǎn)量呈現(xiàn)先增后降趨勢，當(dāng)L-蛋氨酸添加濃度為5～7.5 g/L的SAM產(chǎn)量明顯高于其他濃度下的SAM產(chǎn)量。據(jù)相關(guān)文獻報道，L-蛋氨酸不僅是SAM的合成前體，同時參與細胞內(nèi)的其他代謝反應(yīng)，多種影響因素的綜合作用影響了SAM的生成:首先，L-蛋氨酸作為SAM的合成前體，隨著添加濃度的增大，使SAM的合成速率提高從而增加SAM的積累;其次，增加L-蛋氨酸的濃度，會增強SAM合成酶2基因的表達，但同時又會抑制SAM合成酶1基因的表達［18］，因此，L-蛋氨酸的濃度過低或過高均不利于SAM合成酶的生成，即影響SAM的積累;此外，ATP與L-蛋氨酸在SAM合成酶的催化下合成SAM，而發(fā)酵過程高濃度的L-蛋氨酸會抑制TCA循環(huán)及EMP途徑，導(dǎo)致ATP形成減少［17］，合成前體ATP的減少會使SAM的合成速率下降，減少SAM在細胞內(nèi)的積累量。因此，只有添加適當(dāng)?shù)腖-蛋氨酸時才有助于胞內(nèi)SAM的積累。

圖4 L-蛋氨酸對畢赤酵母搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)SAM的影響考察結(jié)果Fig.4 Comparison of SAM production with different L-Met concentration in P.pastoris fermentaion

2.3 發(fā)酵過程甲醇濃度對SAM搖瓶發(fā)酵的影響

根據(jù)表1中甲醇濃度與SAM生產(chǎn)速率變化，對甲醇濃度進行考察，甲醇濃度具體考察范圍為0～60 g/L，以每隔24 h補加1%甲醇作為對照組，檢測在發(fā)酵過程中生物量、SAM含量的變化，結(jié)果見圖5、圖6。圖5為不同甲醇濃度下畢赤酵母的生長曲線，可見，在不同甲醇濃度下，隨發(fā)酵時間的變化，畢赤酵母生長的變化趨勢是一致的。發(fā)酵結(jié)束時OD值均在45左右，其中甲醇濃度為15 g/L時生物量最高，OD值達到52.0。

比較不同甲醇濃度條件下SAM含量變化曲線(圖6)，可以發(fā)現(xiàn)，控制不同甲醇濃度進行發(fā)酵，SAM的生產(chǎn)呈現(xiàn)不同的增長趨勢。發(fā)酵過程不添加甲醇，SAM產(chǎn)量接近于零，隨著甲醇濃度的增大，SAM的產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加再下降的趨勢，其中，在10～30 g/L的甲醇濃度下進行畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)，最有利于SAM的積累，發(fā)酵結(jié)束后10 g/L和30 g/L甲醇濃度發(fā)酵的SAM產(chǎn)量分別達到1.34 g/L和1.29 g/L，而15 g/L甲醇濃度發(fā)酵的SAM產(chǎn)量最高，達到1.41 g/L。

圖5 不同甲醇濃度下發(fā)酵過程畢赤酵母生長情況Fig.5 Time course of biomass for the expression of SAM by P.pastoris transformant in shake flasks

圖6 不同甲醇濃度下發(fā)酵過程SAM變化Fig.6 Time course for the expression of SAM by P.pastoris transformant in shake flasks

分析不同甲醇濃度下SAM產(chǎn)量的變化速率，可以發(fā)現(xiàn)SAM濃度變化可以分為2個階段:第一階段在24～96 h之間，SAM產(chǎn)量的增加速率基本上為一定值，計算發(fā)酵24～96 h之間的SAM生產(chǎn)速率，結(jié)果見表2。由表2可見，隨著甲醇濃度的增加，SAM生產(chǎn)速率先呈現(xiàn)上升趨勢，在10～30 g/L甲醇濃度下SAM生產(chǎn)速率最大，均達到0.017 g/(L·h);甲醇濃度大于30 g/L，SAM生產(chǎn)速率又呈現(xiàn)下降趨勢，至60 g/L時降至0.007 g/(L·h)。

第二階段為發(fā)酵96 h之后，SAM的產(chǎn)量進入一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)，甲醇濃度小于30 g/L，SAM含量仍然呈現(xiàn)增加的趨勢，其中15 g/L甲醇濃度下SAM生產(chǎn)速率略大于10 g/L，因此最終15 g/L條件下SAM產(chǎn)量更高;而控制甲醇濃度在30 g/L以上進行發(fā)酵，SAM含量不變或下降，表現(xiàn)出明顯的底物抑制現(xiàn)象。由此可見，發(fā)酵過程中不同的甲醇濃度對SAM的產(chǎn)量及L-蛋氨酸的利用有比較大的影響，其中以15 g/L的甲醇最有利。

表2 不同甲醇濃度下的SAM生產(chǎn)速率(發(fā)酵24～96 h)Table 2 Effect of different methanol concentration on SAM production rate

圖7 甲醇對畢赤酵母搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)SAM影響的考察結(jié)果Fig.7 Comparison of SAM production with different Methanol concentration in P.pastoris fermentaion

以甲醇濃度作為橫坐標(biāo)對SAM最大產(chǎn)量進行作圖，得到圖7。由圖7可見，SAM產(chǎn)量隨甲醇濃度的增加呈現(xiàn)先增加再下降的趨勢。因為在甲醇誘導(dǎo)階段，一方面甲醇作為碳源用于細胞的生長、代謝，另一方面，甲醇又作為誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)SAM合成酶的產(chǎn)生，催化ATP和L-蛋氨酸合成SAM。細胞生長需要消耗大量的能量，發(fā)酵液中甲醇濃度過低，細胞處于饑餓狀態(tài)，沒有足夠的能量用于菌體的生長代謝及SAM的合成，SAM的產(chǎn)量偏低;增加發(fā)酵液中的甲醇濃度，可以提供充足的能量供細胞利用。此外，適當(dāng)增加甲醇濃度，也可以提高甲醇氧化酶基因的活性，使SAM合成酶的表達量增加，進而增加SAM的合成;但是，發(fā)酵液中甲醇濃度過高，又會抑制細胞的生長、減弱細胞的代謝甚至導(dǎo)致細胞的死亡［19］，因此，過高的甲醇濃度又會導(dǎo)致SAM的產(chǎn)量下降。

3 討論

畢赤酵母搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)SAM過程中，L-蛋氨酸濃度及甲醇濃度對SAM產(chǎn)量有顯著的影響。發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同初始濃度的L-蛋氨酸，SAM產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加再下降的趨勢，其中以添加7.5 g/L L-蛋氨酸的SAM產(chǎn)量最高，達到0.81 g/L;發(fā)酵過程控制甲醇濃度在10～30 g/L之間，最有利于SAM的生產(chǎn)，24～96 h之間SAM生產(chǎn)速率達到0.017 g/(L·h);15 g/L甲醇濃度下獲得的SAM產(chǎn)量最高，達到1.41 g/L，相比每隔24 h補加1%甲醇的對照組，SAM產(chǎn)量提高了21%。

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