新型咪唑并鄰菲羅啉衍生物對(duì)人端粒G－四鏈體相對(duì)于雙螺旋DNA的選擇性識(shí)別

魏春英，文燁，王俊虹

（山西大學(xué) 化學(xué)與生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 分子科學(xué)研究所，山西 太原 030006）

新型咪唑并鄰菲羅啉衍生物對(duì)人端粒G－四鏈體相對(duì)于雙螺旋DNA的選擇性識(shí)別

魏春英，文燁，王俊虹

（山西大學(xué) 化學(xué)與生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 分子科學(xué)研究所，山西 太原 030006）

G-四鏈體DNA是抗腫瘤藥物研究開(kāi)發(fā)的重要靶點(diǎn)，選擇性識(shí)別并穩(wěn)定G-四鏈體DNA的化合物是潛在的抗腫瘤藥物.文章利用紫外可見(jiàn)吸收滴定，熒光滴定，CD光譜以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移熔點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（FRET-melting）研究了三個(gè)基于鄰菲羅啉的新型衍生物（A，B和C）與人端粒G-四鏈體DNA的相互作用.結(jié)果表明三個(gè)化合物通過(guò)末端堆積方式與G-四鏈體DNA相互作用，結(jié)合常數(shù)（K）約為106mol－1·L.當(dāng)濃度為3μmol·L－1時(shí)，化合物A，B和C分別使G-四鏈體DNA熔點(diǎn)溫度增加（ΔTm）16.2，10.5和10.9℃.而且在10倍過(guò)量雙螺旋DNA存在下均能選擇性識(shí)別并穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu).

端粒;G-四鏈體DNA;鄰菲羅啉;抗癌藥物

0 引言

在人類基因組中約有376 000個(gè)富含鳥(niǎo)嘌呤（G）的序列，如端粒，致癌基因的啟動(dòng)子區(qū)域等［1－2］.在一定實(shí)驗(yàn)條件下這些序列可以折疊成G－四鏈體結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)能抑制癌細(xì)胞中端粒酶催化延長(zhǎng)端粒DNA以及下調(diào)致癌基因的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的無(wú)限增殖，成為抗腫瘤藥物研究開(kāi)發(fā)的重要靶點(diǎn)［3－4］.

自從1997年首次發(fā)現(xiàn)蒽醌衍生物能穩(wěn)定人端粒G－四鏈體DNA并抑制端粒酶活性后，近十多年來(lái)已報(bào)道了多種能穩(wěn)定端粒G－四鏈體的小分子化合物，部分還表現(xiàn)出明顯的端粒酶抑制活性，并能顯著抑制癌細(xì)胞的增殖［5－7］.然而細(xì)胞核中存在大量的雙螺旋DNA，為了提高藥物抗腫瘤治療效果，降低毒副作用，致力于設(shè)計(jì)、合成能在大量雙螺旋存在下選擇性識(shí)別并穩(wěn)定G-四鏈體DNA的小分子化合物就顯得尤為重要.目前，這方面的研究報(bào)道不是很多，而且所報(bào)道的化合物多數(shù)選擇性較差.

1，10鄰菲羅啉衍生物及其金屬配合物具有潛在的生物學(xué)功能，如作為DNA結(jié)構(gòu)探針，具有體外抗腫瘤活性等［8］.為了提高鄰菲羅啉衍生物對(duì)G－四鏈體DNA的選擇性，本文我們適當(dāng)?shù)赝卣沽?，10鄰菲羅啉的平面結(jié)構(gòu)，并引入一系列親水的側(cè)鏈取代基.結(jié)果表明修飾后的鄰菲羅啉衍生物能和G-四鏈體DNA發(fā)生顯著的π－π堆積相互作用，而且能在10倍雙螺旋DNA存在下選擇性識(shí)別并穩(wěn)定G-四鏈體DNA結(jié)構(gòu).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑及儀器

1，10-鄰菲羅啉，對(duì)羥基苯甲醛，1-（2-氯乙烷基）吡咯鹽酸鹽，1-（2-氯乙烷基）哌啶鹽酸鹽，2-二甲氨基氯乙烷鹽酸鹽，二甲胂酸鈉（C2H6AsNaO2·3H2O）購(gòu)于上海晶純?cè)噭┕?人端粒序列5’-G3（T2AG3）3－3’（HTG），5’-CAATCGGATCGAATTCGATCCGATTG-3’（ds26）及其熒光雙標(biāo)記端粒序列5’-FAM-G3（T2AG3）3－TAMRA-3’（F21T）購(gòu)于上海生物工程有限公司.其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.使用前DMF用無(wú)水Na2SO4干燥過(guò)夜后減壓蒸餾，通氮?dú)獬鹾笫褂?

紅外光譜在Shimadzu FTIR 8400S光譜儀上記錄.1H NMR and13C NMR在Bruker DRX300波譜儀上.ESI-MS在LCQ（Finnigan，USA）質(zhì)譜儀上測(cè)試.熒光共振能量轉(zhuǎn)移熔點(diǎn)（FRET-melting）實(shí)驗(yàn)在配有自動(dòng)溫控裝置的瓦里安Cary Eclipse熒光光譜儀上完成，激發(fā)和發(fā)射縫寬均為5 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為483 nm.熒光滴定實(shí)驗(yàn)在Perkin Elmer LS-50B熒光光譜儀上測(cè)試，激發(fā)和發(fā)射縫寬均為10 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm.紫外可見(jiàn)吸收滴定在瓦里安Cary 50紫外可見(jiàn)吸收光譜儀上測(cè)試.CD光譜在DSM 1000園二色光譜儀上測(cè)試（美國(guó)Olis公司）.以上所有測(cè)試溫度均為25℃，樣品池厚度為1 cm.

寡聚核苷酸濃度的測(cè)定及G－四鏈體和雙螺旋DNA的制備：將HTG，ds26或F21T DNA溶解在一定量Milli Q超純水中，充分振蕩至完全溶解，離心收集，然后在95℃測(cè)試260 nm的吸收值并計(jì)算DNA的濃度.其中 HTG，ds26和F21T在260 nm的摩爾消光系數(shù)分別為215 000 mol－1·L·cm－1，253 200 mol－1·L·cm－1和262 000 mol－1·L·cm－1.將測(cè)試了濃度的HTG和ds26分別溶解在緩沖溶液1中，F(xiàn)21T溶解在緩沖溶液2中，95℃加熱5 min后，逐漸冷至室溫，再于4℃冰箱中過(guò)夜，備用.其中緩沖溶液1和2的組成分別為10 mmol·L－1Tris-HCl，100 mmol·L－1NaCl（p H 7.4）和10 mmol·L－1C2H6AsNaO2，100 mmol·L－1NaCl（p H 7.4）.

化合物儲(chǔ)存液的制備：準(zhǔn)確稱取適量化合物A，B或C溶于一定體積的DMSO，配成10 mmol·L－1母液，4℃保存.

1.2 紫外可見(jiàn)吸收滴定實(shí)驗(yàn)

在緩沖溶液1中配制不同濃度的化合物A，B或C 2.0 m L，逐漸滴加G－四鏈體DNA，直到化合物的吸收光譜不再變化.利用方程（1）計(jì)算化合物和G－四鏈體DNA的結(jié)合常數(shù)（K）［9］.

其中［DNA］為G－四鏈體DNA的濃度，εa為每次滴加DNA后化合物的摩爾消光系數(shù)，εf和εb分別為游離和完全鍵合DNA后化合物的摩爾消光系數(shù).根據(jù)斜率和截距的比值求出K值.

1.3 熒光滴定實(shí)驗(yàn)

在緩沖溶液1加入一定量的化合物母液（總體積為2 m L），使終濃度為10μmol·L－1.逐漸加入HTG，直到化合物的熒光譜不再變化為止.

1.4 FRET-melting分析

將0.4μmol·L－1的F21T G-四鏈體與不同濃度（0，2，4和6μmol·L－1）的化合物在緩沖溶液2中等體積混勻，并根據(jù)情況加入終濃度為2μmol·L－1的雙螺旋DNA.溫度每升高2～3℃測(cè)試一次，并在此溫度保持5 min后讀取533 nm的熒光值，origin 7.5作圖，求得不同濃度化合物存在下G－四鏈體DNA的Tm值.體系的溫度變化范圍為5～95℃.

1.5 CD實(shí)驗(yàn)

在緩沖溶液1中加入終濃度為5μmol·L－1的HTG，然后分別加入不同濃度（0，5，10和15μmol·L－1）的化合物，總體積為2 m L，置于CD樣品池中測(cè)試.掃描范圍為220～320 nm，狹縫為2 nm，掃描速度為22 nm／min，累積掃描3次，取平均值.

2 結(jié)果和討論

2.1 化合物的合成

化合物2-（4-乙氧基二甲氨基－苯基）咪唑并［4，5-f］1，10-鄰菲羅啉（A），2-（4-乙氧基哌啶－苯基）咪唑并［4，5-f］1，10-鄰菲羅啉（B），2-（4-乙氧基吡咯烷－苯基）咪唑并［4，5-f］1，10-鄰菲羅啉（C）的詳細(xì)合成步驟參見(jiàn)文獻(xiàn)［10］.終產(chǎn)物用1H和13C NMR，IR和質(zhì)譜進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，其結(jié)構(gòu)式如下所示：

2.2 化合物與G－四鏈體DNA的相互作用研究

在不同濃度G－四鏈體DNA存在下三個(gè)化合物的紫外可見(jiàn)吸收光譜如圖1所示.隨著G－四鏈體的加入，化合物最大吸收峰的強(qiáng)度逐漸減弱，各自的百分減色率如表1所示.減色效應(yīng)的出現(xiàn)表明化合物可能堆積在G－四鏈體的末端，與G－四聚體發(fā)生了顯著的π－π堆積相互作用［11－12］.根據(jù)方程（1）計(jì)算化合物與DNA的結(jié)合常數(shù)K值約為106mol－1·L（表1），表明三個(gè)化合物與G－四鏈體DNA有較強(qiáng)的相互作用.

圖1 不同濃度的 HTG對(duì)化合物 A（30μmol·L－1），B（40μmol·L－1）和C（30μmol·L－1）吸收光譜的影響.箭頭表示隨著DNA濃度的增加，化合物吸收強(qiáng)度的變化.內(nèi)插圖是根據(jù)方程（1）的線性擬合曲線Fig.1 Absorption spectra of the compounds A（30μmol·L－1），B（40μmol·L－1）and C（30μmol·L－1）in the presence of different concentrations of HTG.Arrows indicate the change of absorbance intensity with increase of DNA concentration.Inset is the fit curve according to the equation （1）

表1 化合物A，B和C與DNA的鍵合常數(shù)（Kb）及百分減色率（ΔH%）Table 1 Binding constants and hypochromicities%of the compounds A，B and C to DNA

為了進(jìn)一步研究化合物與DNA的相互作用，又進(jìn)行了熒光滴定實(shí)驗(yàn).如圖2所示，三個(gè)化合物在355和480 nm出現(xiàn)兩個(gè)熒光發(fā)射峰.隨著HTG的加入，355 nm最大發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸增加，盡管480 nm的發(fā)射峰強(qiáng)度變化較小.一般認(rèn)為化合物在疏水環(huán)境中比在水溶液中的熒光強(qiáng)度大，因此355 nm峰強(qiáng)度的增加表明化合物與DNA作用后暴露到疏水環(huán)境中，避免了溶劑水的淬滅［11－12］.結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)化合物與DNA堿基之間發(fā)生了顯著的π－π堆積相互作用.

圖2 不同濃度的 HTG對(duì)10μmol·L－1化合物 A（A），B（B）和C（C）熒光發(fā)射強(qiáng)度的影響.箭頭表示隨著DNA濃度的增加，化合物熒光發(fā)射強(qiáng)度的變化Fig.2 Fluorescence spectra of the compounds A，B and C at 10μmol·L－1 in the presence of different concentrations of HTG.Arrows indicate the change of fluorescence intensity with increase of DNA concentration

2.3 化合物對(duì)G－四鏈體DNA的穩(wěn)定作用及相對(duì)于雙螺旋DNA的選擇性

圖3（P324）是不同濃度化合物存在下，G-四鏈體（0.2μmol·L－1）的FRET-melting曲線.隨著化合物濃度的增大，G-四鏈體的熔點(diǎn)逐漸增加，當(dāng)化合物濃度為3μmol·L－1時(shí)，熔點(diǎn)溫度增加（ΔTm）值分別為16.2，10.5和10.9℃（表2），說(shuō)明三個(gè)化合物都能不同程度地穩(wěn)定G－四鏈體DNA.

為了進(jìn)一步研究化合物對(duì)G－四鏈體DNA相對(duì)與雙螺旋DNA的健合選擇性，在10倍過(guò)量雙螺旋ds 26（2μmol·L－1）存在下進(jìn)行了競(jìng)爭(zhēng)FRET-melting實(shí)驗(yàn).發(fā)現(xiàn)G-四鏈體的ΔTm值幾乎沒(méi)有變化（表2），表明在過(guò)量雙螺旋DNA存在下，三個(gè)化合物都可以選擇性識(shí)別并穩(wěn)定G－四鏈體DNA.

2.4 化合物對(duì)G-四鏈體DNA構(gòu)象的影響

圖4（P324）是在包含Na＋的緩沖體系中，不同濃度化合物存在下HTG的CD譜.HTG在290和265 nm處分別出現(xiàn)一個(gè)正峰和一個(gè)負(fù)峰，這是典型的反平行G-四鏈體構(gòu)象［13］.隨著化合物濃度的增加，HTG峰的正、負(fù)峰強(qiáng)度略為減小，表明化合物與DNA作用后對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)稍有擾動(dòng).

表2 不同濃度的化合物使G-四鏈體（F21T）（0.2μmol·L－1）DNA熔點(diǎn)溫度增加值Table 2 Increase in the melting temperature（ΔTm）of F21T（0.2μmol·L－1）DNA treated with different concentrations of the compounds A，B and C

圖3 不同濃度的化合物A（A），B（B）和C（C）對(duì)HTG DNA熔點(diǎn)溫度的影響Fig.3 Melting temperature curves of HTG DNA in the presence of the different concentration of compounds A，B and C

圖4 不同濃度化合物 A（A），B（B）和C（C）存在下 G－體DNA（5μmol·L－1）的CD譜.r是化合物與DNA的摩爾比Fig.4 CD spectra of G-quadruplex DNA in the presence of the different concentration of the compounds A，B and C.r is the molar ratio of the compound to DNA

3 結(jié)論

本工作利用紫外可見(jiàn)吸收、熒光和CD光譜研究了三個(gè)新型咪唑并鄰菲羅啉衍生物（A，B和C）與人端粒G-四鏈體DNA的相互作用.結(jié)果表明化合物A，B和C可能堆積在G－四鏈體DNA的末端，與G－四聚體平面發(fā)生了顯著的π－π相互作用，結(jié)合常數(shù)約為106mol－1·L.π－π堆積相互作用有效地穩(wěn)定了G-四鏈體結(jié)構(gòu)，3μmol·L－1化合物A，B和C使DNA熔點(diǎn)溫度分別增加16.2，10.5和10.9℃.尤為重要的是，在10倍過(guò)量雙螺旋DNA存在下，三個(gè)化合物都能選擇性識(shí)別和穩(wěn)定G－四鏈體DNA結(jié)構(gòu).這一研究為基于端粒DNA為靶標(biāo)的抗癌藥物研究和設(shè)計(jì)提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù).

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Selective Recognition on Human Telomeric G-quadruplex over Duplex DNAs by Novel Imidazophenanthroline Derivatives

WEI Chun-ying，WEN Ye，WANG Jun-hong
（KeyLaboratoryofChemicalBiologyandMolecularEngineeringofMinistryofEducation，InstituteofMolecularScience，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China）

G-quadruplex DNA is an important target for design of anticancer drugs，so the compounds selectively recognizing and stabilizing the structure of G-quadruplex DNA are the potential antitumor drugs.Here the interactions of three novel phenanthroline-based compounds A，B and C with human telomeric G-quadruplex DNA were studied by absorption titration，fluorescence titration，CD spectroscopy and FRET-melting methods.The results show that the three compounds bind to G-quadruplex DNA by end-stacking mode with the association constant（K）of about 106mol－1·L.The compounds A，B and C can selectively recognize and stabilize G-quadruplex structure at level of 10-fold excess of duplex DNA，with the increase of the melting temperature（ΔTm）of 16.2，10.5 and 10.9℃at 3μmol·L－1concentration，respectively.

telomere;G-quadruplex;phenanthroline;anticancer drug

O625.6

A

0253-2395（2012）02-0320-06＊

2011-07- 07;

2011-08-24

國(guó)家自然科學(xué)基金（ 21041008;21171108）;教育部博士點(diǎn)專項(xiàng)基金（20101401110009）;山西省自然科學(xué)基金（2009011012-2）;山西省回國(guó)留學(xué)人員科研項(xiàng)目（2011-016）;山西省留學(xué)擇優(yōu)資助項(xiàng)目（2009）

魏春英（1970－），女，山西廣靈人，博士，教授，主要研究方向：生物無(wú)機(jī)化學(xué).E-mail：weichuny＠sxu.edu.cn

book=325,ebook=168