組織塊貼壁法培養(yǎng)人腸系膜動脈平滑肌細胞的研究

國強華，宋維鵬，王慶勝，劉 麗

組織塊貼壁法培養(yǎng)人腸系膜動脈平滑肌細胞的研究

國強華1，宋維鵬2，王慶勝1，劉 麗1

目的采用組織塊貼壁法建立成人腸系膜動脈血管平滑肌細胞體外模型，為心血管疾病研究提供實驗基礎(chǔ)。方法運用組織塊貼壁法對成人腸系膜動脈平滑肌細胞進行原代培養(yǎng)，用倒置顯微鏡和免疫組化進行細胞形態(tài)學(xué)觀察和鑒定。結(jié)果運用組織塊貼壁法成功獲得大量單個成人腸系膜動脈平滑肌細胞，培養(yǎng)的細胞呈典型“峰－谷”樣生長，免疫組化顯示胞漿內(nèi)平滑肌肌動蛋白陽性表達。經(jīng)胰酶消化后可傳20代。結(jié)論通過組織塊貼壁法可以獲得成人動脈平滑肌細胞(human vascular smooth muscle cell，hVSMC)，為心血管疾病的實驗研究提供良好的材料。

人;腸系膜動脈;平滑肌;細胞培養(yǎng)

動脈中膜的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)在心血管疾病發(fā)生中具有重要作用。研究表明，高血壓、動脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄等多種疾病的病理過程常伴有VSMC的舒縮、遷移、增殖和纖維化。動脈血管平滑肌細胞的培養(yǎng)已經(jīng)被廣泛用于心血管疾病發(fā)病機制的研究［1－3］。目前，國內(nèi)外大多數(shù)實驗室仍選用動物的動脈作為血管平滑肌細胞體外培養(yǎng)的來源［4，5］，很少采用成人動脈。盡管動物的血管平滑肌細胞較容易培養(yǎng)，但其生物學(xué)特性與人的血管平滑肌細胞存在不少的差異，特別是在基因表達、抗原特異性方面，據(jù)此得出的實驗結(jié)果并不能準確反映人體的實際情況。本實驗旨在通過組織塊貼壁法建立穩(wěn)定的成人動脈血管平滑肌細胞體外培養(yǎng)模型［6，7］，為開展相關(guān)實驗打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑及液體配置 DMEM/F12干粉(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、胰蛋白酶(Trypsin，Sigma公司)、EDTA(Boehringe公司)、青霉素、鏈霉素、生理鹽水、PBS緩沖液、DHank’s液、25 ml塑料培養(yǎng)瓶(Coming公司)、抗平滑肌Actin單克隆抗體和免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物公司)。將培養(yǎng)液配成含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，每毫升中加入100 U青霉素和100 μg鏈霉素，調(diào) pH值為7.0;100ml DHank液中加0.25 g胰蛋白酶和0.125 g EDTA配成濃度為0.25%胰酶和0.0125%EDTA的混合溶液，調(diào)pH值為8.0。配好的試劑分裝后－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 成人腸系膜動脈的分離 選擇腹部外科手術(shù)中摘除的腸系膜動脈［供體年齡為(50±5)歲，無高血壓及器質(zhì)性心血管疾?。?，該醫(yī)療行為得到秦皇島市第一醫(yī)院倫理委員會的許可。手術(shù)室中分離切取人腸系膜動脈5～8 cm，用生理鹽水將血管內(nèi)外的血跡反復(fù)沖洗干凈，移入含20%胎牛血清的無菌DMEM/F12培養(yǎng)液中。

1.3 VSMC的原代培養(yǎng) 實驗室超凈臺內(nèi)，在PBS平衡液的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用眼科鑷去除血管外膜及結(jié)締組織，露出白色的中膜，放入另一無菌培養(yǎng)皿中，縱向剪開血管，將血管內(nèi)壁沖洗數(shù)次，用無菌棉花輕輕擦拭數(shù)次以除去內(nèi)膜只留取中膜，眼科鑷夾取中膜組織，用1 ml含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液反復(fù)沖洗后，放入另一無菌培養(yǎng)皿中，滴少許含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，用眼科剪剪成1 mm的小塊，用彎頭吸管將小塊移入25 ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，以3～5塊/cm2密度均勻貼于培養(yǎng)瓶底，培養(yǎng)瓶底內(nèi)加入1 ml含20%胎牛血清的無菌DMEM/F12培養(yǎng)液，緩慢豎直培養(yǎng)瓶，以培養(yǎng)液剛未浸沒小塊為宜，放至5%CO2、37℃培養(yǎng)箱干涸2～4 h后輕輕翻轉(zhuǎn)，使小塊剛好浸入培養(yǎng)液中，原代培養(yǎng)每3 d換1次液，待4～5周細胞長滿培養(yǎng)皿后即可傳代。

1.4 VSMC的傳代培養(yǎng) 傳代前1 d換液1次，傳代時棄去原培養(yǎng)液，PBS輕輕沖洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶和0.0125%EDTA的混合溶液2 ml，培養(yǎng)箱中消化90 s，鏡下觀察見細胞收縮變圓、間隙增寬，立即加入新鮮培養(yǎng)液4 ml終止消化，用彎頭吸管將細胞均勻吹打下來，離心后制成細胞懸液，細胞計數(shù)板計數(shù)達到107個/ml，調(diào)整細胞濃度為105個/ml，按1∶2傳代，每3 d換液1次，傳代周期為6～9 d。

1.5 形態(tài)學(xué)觀察及細胞鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)觀察 應(yīng)用相差顯微鏡觀察細胞大小、形態(tài)、生長特點及排列方式等。

1.5.2 免疫細胞化學(xué)染色 將第3代細胞胰蛋白酶消化后以105個/ml的細胞濃度接種于置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，待細胞長至60%后取出細胞爬片，PBS清洗5次，每次5 min。用4%多聚甲醛固定20 min，再PBS沖洗5次，每次5 min，然后用抗平滑肌Actin單克隆抗體進行免疫細胞化學(xué)染色，以VSMC胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色為陽性結(jié)果，同時計數(shù)陽性百分率。

2 結(jié) 果

2.1 體外培養(yǎng)生長情況 原代成人腸系膜動脈平滑肌細胞貼壁牢固，3～4周后細胞呈充分伸展梭型，4～5周后即可傳代，傳代后12 d即可貼壁，4～5 d可出現(xiàn)VSMC特有的“峰－谷”樣生長，這是平滑肌特征性生長表現(xiàn)(圖1)。

圖1 hVSMC細胞體外培養(yǎng)生長情況

2.2 形態(tài)學(xué)觀察和鑒定 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，未貼壁前細胞呈圓形或橢圓形，胞質(zhì)密度高，不透明，胞核多為卵圓形，有多個核仁;貼壁后細胞胞質(zhì)透明，彼此融合在一起，細胞呈梭形或多角形，核居中央，呈橢圓形(圖2)。免疫組織化學(xué)檢測平滑肌α－肌動蛋白表達呈陽性顯示，細胞計數(shù)陽性率為98%。

圖2 hVSMC細胞免疫組織化學(xué)鑒定反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色(×200)

3 討 論

研究血管平滑肌細胞的生物學(xué)行為是且前探討動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的熱點之一［6，7］，然而成人的血管平滑肌細胞(hVSMC)培養(yǎng)難度很大，目前大多數(shù)的實驗室仍用較易培養(yǎng)的動物血管平滑肌細胞來代替hVSMC，但鑒于其生物學(xué)特性與人源細胞存有一定差異，特別是在基因表達、抗原特異性方面，故使用人的血管平滑肌細胞成為許多心血管疾病研究的理想材料［1，8］。

本實驗成功地建立了用人的腸系膜動脈培養(yǎng)血管平滑肌細胞的體外模型，培養(yǎng)的平滑肌細胞呈典型“峰－谷”樣生長，免疫組化顯示胞漿內(nèi)平滑肌肌動蛋白陽性表達。組織塊貼壁法簡單、經(jīng)濟，經(jīng)過一定時間的初步訓(xùn)練，即可掌握相關(guān)的無菌操作和技術(shù)。本實驗需注意以下幾點:(1)培養(yǎng)液。選用DMEM/F12培養(yǎng)液，因其內(nèi)Ca2+和Mg2+含量高，營養(yǎng)豐富并含有利于細胞生長的因子及成分，保證成人血管平滑肌細胞在體外培養(yǎng)生長良好。培養(yǎng)液配置時的pH值應(yīng)在7.0左右，因為hVSMC耐酸不耐堿，在稍微偏酸性的環(huán)境下生長的比較好。(2)血清。胎牛血清比小牛血清好，原代培養(yǎng)時用20%(v/v)胎牛血清，傳代培養(yǎng)時可改用l0%(v/v)胎牛血清。(3)組織塊。不應(yīng)剪切過小，1 mm2最合適，否則組織塊損傷大，水分容易喪失，導(dǎo)致原代培養(yǎng)失敗。組織塊間距需2～3 mm，以保證細胞從組織塊游出后有足夠的生長空間并保持局部細胞密度的均勻，從而獲得更多的原代細胞。(4)原代培養(yǎng)。如果有組織塊未貼壁，可將其重新擺放至瓶底，干涸2～3 h后，使其重新貼壁，再浸沒于培養(yǎng)液中。該法不會影響同瓶中其他已萌出細胞的生長。(5)細胞純度。組織塊貼壁法培養(yǎng)的平滑肌細胞純度相對低，但是傳代至第3代時，細胞的純度即可達到95%以上，適于進行后期實驗。(6)免疫組化。α－平滑肌肌動蛋白(α－SMA)是細胞內(nèi)六種肌動蛋白亞類之一，在所有真核細胞中的表達都高度保守。它們沿微管組成了細胞骨架的主要成分，編碼它的基因是相對局限于在血管平滑肌細胞中表達的少數(shù)幾個基因之一，公認是血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化的標志。

本研究建立了用人的腸系膜動脈培養(yǎng)血管平滑肌細胞的體外模型，所介紹的組織貼塊法培養(yǎng)的成人腸系膜動脈平滑肌細胞，較為成熟，簡單、經(jīng)濟、易行，可為心血管疾病病因、機制的研究和防治提供一個理想的實驗材料。

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Experimental study of human mesenteric artery smooth muscle cell cultured by tissuepiece inoculation

GUO Qianghua，SONG Weipeng，WANG Qingsheng，and LIU Li.1.Department of Cardiology;2.ICU，Qinhuangdao First Hospital，Qinhuangdao 066000，China

ObjectiveTo establish a method for culture of human mesenteric artery smooth muscle cell(hVSMC)by tissuepiece inoculation in vitro and to provide new technology to study cardiovascular diseases.Methods The tissue－piece inoculation method was applied to cell primary culture of hVSMC.Morphology of the cells was observed by inverted microscopy and identified by immunohistochemical methods.Results A great quantity of single hVSMC were obtained by tissue－piece inoculation.The cultured hVSMC showed typical“peak and valley”pattern and immunohistochemical staining showed that all the cells were positive.Conclusions The hVSMC are obtained by tissue－piece inoculation.This method provides good study material to research cardiovascular diseases.

human beings;mesenteric artery;smooth muscle cells;cell culture

R541.3

國家十一五科技支撐計劃資助課題(2006BMI01A03－2)

國強華，男，1979年出生。碩士，主治醫(yī)師。主要從事老年心血管病研究。

066000，秦皇島市第一醫(yī)院:1.心內(nèi)三科;2.重癥醫(yī)學(xué)科通訊作者:劉 麗，E－mail:lucy301bj@vip.sina.com

(2012－06－08收稿 2012－07－26修回)

(責(zé)任編輯 梁秋野)

臨床經(jīng)驗總結(jié)