離子色譜－電導檢測法測定不同乳制品中硫氰酸鹽

張水鋒 陳小珍 張東雷 李紅艷 陳萬勤

（浙江省質(zhì)量檢測科學研究院浙江省食品安全重點實驗室，杭州 310013）

離子色譜－電導檢測法測定不同乳制品中硫氰酸鹽

張水鋒 陳小珍＊張東雷 李紅艷 陳萬勤

（浙江省質(zhì)量檢測科學研究院浙江省食品安全重點實驗室，杭州 310013）

建立了離子色譜－電導檢測分析不同類型乳制品中硫氰酸鹽（SCN－）污染物的方法，重點研究了不同形態(tài)樣品如固態(tài)類（奶粉）、液態(tài)類（牛奶）、凝固態(tài)類（凝固型酸奶）和半流質(zhì)態(tài)類（煉乳）等乳制品中的硫氰酸鹽前處理方法，采用丙酮作為蛋白沉淀劑，有效實現(xiàn)了對各類樣品中蛋白質(zhì)的沉淀和對硫氰酸鹽的提取，避免了以往采用乙腈處理樣品時容易分層的弊端，方法在0～5.0mg／L濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.9997（n＝6），方法檢出限（LOD）為0.15～0.5μg／g，方法回收率為95.0%～105.0%，相對標準偏差（RSD）為1.4%～5.6%（n＝3）。

硫氰酸鹽；乳制品；離子色譜；電導檢測；前處理；食品安全

1 引言

在20世紀80年代，受制冷技術(shù)限制硫氰酸鈉曾被作為保鮮劑而在乳品行業(yè)廣泛應用。但由于硫氰酸鈉對人體具有較大毒性，自2008年12月起，衛(wèi)生部已將硫氰酸鈉列入非法食品添加物質(zhì)名單。因此，為了確保食品安全亟需發(fā)展乳制品中硫氰酸鹽污染物的檢測方法。

目前，已報道的用于測定硫氰酸根（SCN－）的方法主要有熒光動力學法［1］、電化學法［2－3］、流動注射法［4］、高效液相色譜法［5］、毛細管電泳法［6］、氣相色譜法［7］等。離子色譜法［8－10］測定SCN－具有無須衍生、操作簡單、響應穩(wěn)定等優(yōu)點而備受關(guān)注。已報道的有關(guān)離子色譜測定乳制品中SCN－含量的文獻主要討論乙腈的前處理效果，而對采用不同有機溶劑處理樣品方面的研究報道得較少。本課題組研究了多種溶劑對全脂奶粉的前處理效果，確定了以丙酮作為蛋白沉淀劑的樣品前處理方法［11］，可有效避免乙腈沉淀蛋白質(zhì)時溶液分層現(xiàn)象。研究中就不同類型如固態(tài)類（奶粉）、液態(tài)類（牛奶）、凝固態(tài)類（凝固型酸奶）、半流質(zhì)態(tài)類（煉乳）等樣品的前處理方法進行了探討，開發(fā)了基于丙酮沉淀蛋白的各種乳制品的離子色譜分析方法及樣品前處理方法。方法穩(wěn)定可靠、通用性好，適合各類乳制品中硫氰酸鹽殘留量的質(zhì)量監(jiān)控。

2 實驗部分

2.1 試劑與材料

實驗用水均為Millipore超純水機制備的去離子水；所用試劑主要有乙腈（分析純）、甲醇（色譜純）、丙酮（分析純）、硫氰酸鉀（優(yōu)級純）、無水乙醇（優(yōu)級純）均為國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品。

硫氰酸根（SCN－）標準儲備液（1 000μg／mL）：將硫氰酸鉀標準品于80℃烘箱內(nèi)烘干2h。準確稱取干燥后的硫氰酸鉀1.6732g于1 000mL容量瓶中，定容、混勻。

SCN－標準工作溶液：移取適量SCN－標準儲備液稀釋至所需濃度而得。

固相萃取小柱：DIKMA C18（500mg／6mL）為迪馬公司產(chǎn)品。

一次性水系（纖維素）、有機系（尼龍）針式濾膜（0.45μm，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）。

2.2 儀器

DX－600離子色譜系統(tǒng)（美國戴安公司），配備AS40自動進樣器、淋洗液自動發(fā)生器、電導檢測器和抑制器；BIOFUGE STRATOS高速冷凍離心機（美國Thermo）；WH－861旋渦混合儀（太倉市華利達實驗設(shè)備有限公司）；DS－3510DTH超聲波儀（上海生析超聲儀器有限公司）。

2.3 實驗方法

2.3.1 色譜條件

色譜柱為陰離子交換柱IonPac AS16，4.0mm× 250mm分析柱；IonPac AG16，4.0mm×50mm保護柱。流動相為KOH溶液（由淋洗液在線發(fā)生器在線生成），梯度淋洗模式（0～5.0min，40mmol／L；5.1～13.0min，60mmol／L；13.1～18.0min，40mmol／L）；流速為0.8mL／min。抑制器為抑制電流139mA，自抑制模式，柱溫為30℃，檢測池溫度30℃，定量環(huán)體積為100μL，滿環(huán)進樣。

2.3.2 樣品前處理方法

固相萃取小柱活化：將C18固相萃取小柱依次用5mL甲醇，10mL去離子水進行活化處理，待用。

固態(tài)類樣品（如奶粉等）：稱取樣品約1.0g（精確至0.0001g）于10mL具塞比色管中，加入去離子水4.0mL，旋渦1min，超聲提取5min。用丙酮定容至10mL，旋渦混合1min，轉(zhuǎn)移至50mLPVC高速離心管中，于12000r／min、4℃下高速離心15min。取上層清液1mL稀釋10倍，過處理好的C18固相萃取小柱去除脂肪、有機酸等干擾物質(zhì)，棄去前面濾液約2mL，接取后段濾液過0.45μm針式有機系濾膜后上機測試。

凝固態(tài)類樣品（如凝固型酸奶等）、半流質(zhì)態(tài)類樣品（如煉乳等）：稱取約2.0g樣品（精確至0.0001g）于10mL具塞閉塞管中，加入2mL去離子水，旋渦混勻，超聲5min，用丙酮定容至10mL（丙酮量約為5mL），旋渦混勻，轉(zhuǎn)移至50mLPVC高速離心管，于4℃、12000r／min下高速離心15min，取上層清液1mL稀釋10倍，過C18固相萃取小柱，棄去前面2mL流出液，接取后面的流出液，并過0.45μm針式有機系濾膜后上機測試。

液態(tài)類樣品（如牛奶等）：稱取約4.0g（精確至0.0001g）樣品于10mL具塞比色管中，用丙酮定容至10mL刻度線（丙酮用量約為5～6mL），旋渦混勻，超聲5min，轉(zhuǎn)移到50mLPVC高速離心管中，于4℃、12000r／min下高速離心15min，取上清液1mL稀釋10倍，過C18固相萃取小柱，棄去前面2mL流出液，接取后面的流出液，并過0.45μm針式有機系濾膜后上機測試。

3 結(jié)果與討論

3.1 前處理方法的確定

為了定量計算方便，根據(jù)最終產(chǎn)品的形態(tài)將乳制品分為固態(tài)類（如奶粉）、液態(tài)類（如牛奶）、凝固態(tài)類（如凝固型酸奶）、半流質(zhì)態(tài)類（如煉乳）四類。鑒于硫氰酸鹽無機鹽的屬性和離子色譜的特點，樣品前處理的基本原則是：首先用去離子水對目標物進行提取，再采用有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)，進而用固相萃取小柱去除脂肪等有機物，得到測試液。

對于奶粉等固體樣品，硫氰酸鹽以固體形式存在，宜先加入去離子水對其進行提取；然后再對蛋白質(zhì)進行沉淀，加入去離子水的量以樣品與水的質(zhì)量比1∶4為佳。

對于凝固型酸奶、半流質(zhì)的煉乳等樣品，硫氰酸鹽的存在方式較為復雜，也宜先加入適量去離子水對樣品進行分散提取，加入去離子水的量以質(zhì)量比1∶1為佳。

而對于牛奶等液體樣品，硫氰酸鹽以離子形式存在，可直接加入蛋白沉淀劑進行處理。

實驗中也考察了“加水提取步驟”的影響，奶粉樣品中不加水直接用丙酮提取測得值僅為加水提取處理的15.6%。對于凝固型酸奶樣品，不加水處理測得值是加水處理的87.8%?？梢?，加水步驟在處理上述兩類樣品時具有重要意義。

3.2 蛋白沉淀劑選擇

蛋白沉淀劑的優(yōu)化選擇是影響后續(xù)離子色譜分析性能的重要因素。考察了不同有機溶劑甲醇、乙醇、乙腈、丙酮對樣品的前處理效果，實驗表明甲醇和乙醇的處理效果不如乙腈、丙酮對蛋白質(zhì)沉淀得徹底。但乙腈在處理樣品時，溶液在低溫時容易分成上下兩層，導致無法準確定量。采用丙酮處理樣品，蛋白質(zhì)沉淀徹底，并且不存在分層現(xiàn)象。通過對丙酮加入體積的優(yōu)化得到，對于不同類型的乳制品，按“2.3.2樣品前處理”進行取樣時，加入丙酮的體積以5～7mL為佳。圖1（A）是在優(yōu)化條件下標準溶液（0.5μg／mL）的標準色譜圖，圖1（B）是實際樣品的色譜圖。

圖1 硫氰酸鹽標準色譜圖（A）和實際樣品的色譜圖（B）Figure 1.Chromatograms of 0.5g／mLstandard solution（A）and real samples（B）.

3.3 超聲處理時間

實驗發(fā)現(xiàn)，超聲處理對固態(tài)、凝固態(tài)、半流質(zhì)態(tài)等樣品提取SCN－過程有較大影響。實驗考察了超聲時間在0～20min范圍內(nèi)對實驗的影響，結(jié)果表明，采用超聲處理時間為5min時，即可實現(xiàn)對樣品中硫氰酸鹽的有效提取。

3.4 不同濾膜對測定的影響

分別考察水系濾膜、有機系濾膜對檢測結(jié)果的影響，實驗表明，水系濾膜對硫氰酸根具有較強的吸附作用，如圖2所示，對0.5μg／mL的標準溶液采用水系濾膜過濾后上機測試，所得結(jié)果僅為0.17μg／mL，濃度下降66%。因此前處理過程中采用水系濾膜過濾樣液，則會導致測定結(jié)果偏小。而采用有機系濾膜處理樣品，對測定結(jié)果影響較小。

3.5 線性范圍、回收率和方法精密度

配制SCN－標準曲線的濃度分別為0.0、0.05、0.5、1.0、2.0、5.0mg／L，直接進樣測定相應的峰面積，對“SCN－濃度（y）－峰面積（x）”作標準曲線。在給定范圍內(nèi)，濃度和峰面積呈線性響應，其線性方程為：y＝0.709x－0.009（n＝6），相關(guān)系數(shù)r＝0.9997。根據(jù)“2.3.2樣品前處理方法”對樣品的分類，以3倍信噪比計，固態(tài)類、液態(tài)類、凝固態(tài)類、半流質(zhì)態(tài)類樣品的檢出限（LOD）分別為0.5、0.15、0.25、0.25μg／g。

分別稱取4.0g（精確至0.0001g）鮮牛奶、1.0g（精確至0.0001g）奶粉、2.0g（精確至0.0001g）凝固型發(fā)酵乳樣品3批，分別按表1進行加標回收實驗，結(jié)果如表1所示，方法回收率為95.0%～ 105.0%，RSD為1.4%～5.6%（n＝3）。

圖2 濾膜吸附對測定結(jié)果的影響Figure 2.Effects of the membrane absorption on the peak heights.

表1 方法回收率實驗Table 1 Spiked recoveries of SCN－in the samples（n＝3）／（μg·g－1）

3.6 實際樣品測定

用離子色譜法對4類乳制品（每類4批樣品，每批分別測定3次取平均值）進行檢測，結(jié)果列于表2。從表2可知，所檢測的實際樣品中均含有一定量的SCN－，其含量在0.9～17.9mg／kg范圍內(nèi)。有研究表明［15］牛奶中本身會含有一定水平的SCN－，其含量受奶牛品種、個體、飼養(yǎng)方式等因素影響有很大差異；而牛奶經(jīng)過濃縮制成其乳制品，其天然存在的SCN－含量會相應提高。

表2 樣品中SCN－的濃度（n＝3）Table 2 SCN－Concentrations in real samples（n＝3）（mg·kg－1）

4 結(jié)論

根據(jù)乳制品的不同形態(tài)（固態(tài)、液態(tài)、凝固態(tài)和半流質(zhì)態(tài)），分別建立了各類型產(chǎn)品的樣品中SCN－的前處理方法，并采用離子色譜－電導檢測法進行分析，方法快捷方便、實用可靠，為全面監(jiān)測乳制品中硫氰酸鹽污染物提供了可靠的分析手段。

［1］Meeussen J C L，Temminghoff E J M，Keizer MJ，et al.Spectrophotometric determination of total cyanide，ironcyanide complexes，free cyanide and thiocyanate in water by a continuous－flow system［J］.Analyst，1989，114（8）：959－963.

［2］Shamsipur M，Ershad S，Samadi N，et al.The first use of a Rh（III）complex as a novel ionophore for thiocyanateselective polymeric membrane electrodes［J］.Talanta，2005，65（4）：991－997.

［3］Xu W，Chai Y，Yuan R，et al.A novel thiocyanate－selective electrode based on a zinc－phthalocyanine complex［J］.Anal.Bioanal.Chem.，2006，385（5）：926－930.

［4］Van Standen J F，Botha A.Spectrophotometric determination of thiocyanate by sequential injection analysis［J］.Anal.Chim.Acta.，2000，403（1－2）：279－286.

［5］Liu X，Yun Z.High－performance liquid chromatographic determination of thiocyanate anion by derivatization with pentafluorobenzyl bromide［J］.J.Chromatrogr.A，1993，653（2）：348－353

［6］Glatz Z，NovákováS，?těrbováH.Analysis of thiocyanate in biological fluids by capillary zone electrophoresis［J］.J.Chromatrogr.A，2001，916（1－2）：273－277.

［7］鐘良康，方波.超短柱頂空氣相色譜法測定尿中硫氰酸鹽［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2005，15（5）：568，628.

［8］墨淑敏，梁立娜，蔡亞岐，等.高效陰離子交換色譜在易極化陰離子痕量分析中的應用［J］.色譜，2005，23（6）：677－680.

［9］孟利.高效陰離子交換色譜法測定生鮮乳中硫氰酸鹽的含量［J］.食品科學，2010，31（6）：227－229.

［10］李靜，王雨，梁立娜.離子色譜法同時分析奶粉中碘離子和硫氰酸根［J］.分析試驗室，2010，29（5）：17－20.

［11］張水鋒，林珍珍，陳小珍，等.基于離子色譜／電導檢測的全脂奶粉中硫氰酸鹽污染物的測定及前處理方法研究［J］.分析測試學報，2012，31（1）：85－89.

Determination of Thiocyanate Contaminant in Different Types of Dairy Products by Ion Chromatography with Conductivity Detection and Sample Pretreatment

ZHANG Shuifeng，CHENXiaozhen＊，ZHANG Donglei，LI Hongyan，CHENWanqin
（ZhejiangKeyLabofFoodSafety，ZhejiangInstituteofQualityInspectionScience，Hangzhou310013，China）

A method was developed for analysis of thiocyanate（SCN－）contaminant in different types of dairy products using ion chromatography with conductivity detection.The focus was on the sample pretreatment for analyzing different forms of dairy products including solid state（milk powder），liquid（milk），condensed state（yoghurt）and semi－liquid state（condensed milk）.Acetone was used to precipitate protein and results showed that acetone can precipitated all kinds of proteins and extract the thiocyanate（SCN－）contaminant and also avoid the stratification problem occurred when acetonitrile was used as the protein precipitant.Under the optimal conditions，the calibration curve was linear in the range of 0～5.0mg／L，with the linear correlation coefficient ofr＝0.9997（n＝6）.And for different types of dairy products，the limits of detection（LOD）were in the range of 0.15μg／g to 0.5μg／g，the recoveries were between 95.0%to 105.0%，and the relative standard variations（RSD）were about 1.4%to 5.6%（n＝3）.

thiocyanate；dairy product；ion chromatography；conductivity detection；pretreatment；food safety

＊通訊作者：陳小珍，女，教授級高工，主要從事食品安全及分析的研究。E－mail：cxz730＠163.com

O657.7＋5；TH833

A

2095－1035（2012）03－0060－04

10.3969／j.issn.2095－1035.2012.03.019

2012－07－02

2012－07－31

浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技計劃項目（20100206，20090208）；浙江省科技計劃項目（2009F70033）。

張水鋒，男，高級工程師，主要從事食品安全及分析的研究。E－mail：seafling＠163.com