液相色譜－電化學衍生－光學檢測技術研究進展

吳述超 張嘉捷 周琰春 鄭存江 朱巖＊

（1中國地質大學（武漢），武漢 430074；2浙江省地質礦產研究所，杭州 310007；3浙江大學化學系，杭州 310028；4浙江大學校醫(yī)院，杭州 310027）

液相色譜－電化學衍生－光學檢測技術研究進展

吳述超1，2，3張嘉捷3周琰春4鄭存江2朱巖3＊

（1中國地質大學（武漢），武漢 430074；2浙江省地質礦產研究所，杭州 310007；3浙江大學化學系，杭州 310028；4浙江大學校醫(yī)院，杭州 310027）

綜述了以反相鍵合相為主的高效液相色譜－柱后電化學衍生－熒光檢測（RP－HPLC／ED／FD）技術的研究進展。對RP－HPLC／ED／FD存在的主要問題進行了討論。并介紹了離子色譜－柱后電化學衍生－光學聯(lián)用裝置的構建及其在極性有機物和金屬離子的測定方面的應用研究。

高效液相色譜；電化學衍生；熒光；離子色譜

1 前言

色譜技術中的衍生法是指色譜過程中借助于化學、電化學或者光化學反應，使樣品化合物轉變成相應的衍生物后再進行分離檢測或者直接進行測定的方法。衍生法具有提高檢測靈敏度、改善樣品組分間分離度等作用。色譜技術中的柱后衍生法以化學衍生和光化學衍生應用較為廣泛，已經有相關文章詳細綜述了這兩種衍生方法的研究進展［1－2］，現(xiàn)就柱后電化學衍生在液相色譜（包括反相高效液相色譜和離子色譜）中的應用進行綜述。

2 高效液相色譜－電化學衍生－熒光檢測技術

柱后電化學衍生在液相色譜中的應用較少，且只和熒光檢測器聯(lián)用。至今為止，僅有6篇文獻報導以反相液相色譜－柱后電化學衍生－熒光法（RPHPLC／ED／FD）測定多環(huán)芳烴［3－4］、酚［5］、噻吩嗪［6］、甲氨蝶呤［7］、兒茶酚胺［8］等物質，相關信息列于 表1。

表1 RP－HPLC／ED／FD法應用實例Table 1 Examples of HPLC／ED／FD applications

RP－HPLC／ED／FD首先由Dasgupta等在1996年提出［3］，以此方法來測定柴油發(fā)動機尾氣中硝基取代的多環(huán)芳烴（NPAHs）。多環(huán)芳烴具有強熒光性質，但由于硝基的吸電子作用，硝基取代的多環(huán)芳烴不具有熒光，NPAHs上的硝基若被還原成NHOH或者NH2，由于NHOH或NH2是給電子基團，具有NHOH或者NH2的多環(huán)芳烴將具有強熒光性質?；诖朔N原理，Dasgupta等以反相液相色譜分離多環(huán)芳烴，將電化學檢測器和熒光檢測器串聯(lián)，聯(lián)合檢測NPAHs。

文中對NPAHs的電化學還原機理及淋洗液、支持電解液的pH值進行研究，指出多環(huán)芳烴上的取代基NO2被還原成NH2要經過中間產物NHOH過程，流動相的適宜pH值為2.8。作者指出1－硝基－萘的電化學還原產物是1－氨基－萘。1nmol的1－硝基－萘的電量是約25μC，以反應的電子數為6計，電化學還原效率約為5%，在相同物質的量的情況下，1－氨基－萘的熒光信號約為還原后的1－硝基－萘的20倍。分析物的熒光檢測限在0.75～4.5pmol（以3倍信噪比計）。

Dasgupta等創(chuàng)造性地將電化學檢測器和熒光檢測器聯(lián)用，電化學檢測器在整個分析方法中起電化學還原作用，而非檢測作用。從衍生的角度來看，該方法就是RP－HPLC／ED／FD的最初形式。實驗結果雖然由于儀器條件的限制略顯粗糙，但無可否認，其方法的創(chuàng)新性、對反應機理的詳細探討及各種有價值的設想為其他研究者提供較好的參考。

在此文章的啟發(fā)下，2003年Uwe Karst等建立了RP－HPLC／ED／FD法測定單取代酚類物質［5］。酚類物質具有弱熒光性質，可被氧化為酚的二聚體或多聚體，這些多聚體化合物具有較強熒光性質［9］。Karst等根據此原理，以反相高效液相色譜的C18柱分離酚類物質，先以紫外檢測器檢測，接著通過電化學衍生裝置，在900mV的電勢下，進行電化學氧化反應，衍生后的產物和外加堿液混合，以熒光檢測器檢測。實驗流程見圖1。

圖1 液相色譜－電化學衍生－熒光檢測法分析酚類物質流程圖［5］Figure 1.A flow chart for phenol detection by RP－HPLC／ED／FD.

作者詳細討論了電化學衍生及介質的pH值對衍生產物信號的影響。由于分離柱為硅膠基質的反相色譜柱，流動相的pH值范圍為2～8，而酚類的熒光測定在堿性介質中最為靈敏，所以需要在電化學衍生后加入堿性緩沖液（pH＝9.5）以提高靈敏度。作者對11種單取代酚類物質進行了研究，并以烷基酚類為例，以流動注射－電化學氧化－紫外法和流動注射－電化學氧化－質譜法研究了酚類物質的電化學氧化機理，指出在電化學氧化作用下，酚通過C—C鍵耦合為二聚體、三聚體等多聚體化合物。對于某些酚類，如4－壬基酚、4－乙基酚，方法的檢測限可至20fmol（進樣量為10μL）。

RP－HPLC／ED／FD法測定酚類物質是繼Dasgupta之后的一大進展，電化學氧化和堿性緩沖溶液的使用，極大地提高了方法的靈敏度，電化學衍生和熒光檢測器的結合，進一步彰顯了方法的選擇性。但是，該方法存在以下缺點：（1）實驗流程中緩沖溶液的使用，需要額外增加一個輸液泵和混合器，流程較為復雜，增加了分析成本，并且有可能造成譜峰展寬；（2）該方法的選擇性需要在實際樣品分析中進行進一步檢驗。

RP－HPLC／ED／FD法還應用于檢測多環(huán)芳烴［4］、噻吩嗪類［6］和甲氨蝶呤［7］等物質，在上述方法中，所用的電化學衍生裝置均為商品化的安培檢測器或者庫侖流通池。2000年Kazuhiro Imai等［8］設計了一個庫侖流通池，用在微型液相色譜系統(tǒng)中，以兒茶酚胺為試驗分析物，以熒光檢測器和化學發(fā)光檢測器來檢測兒茶酚胺被電化學氧化前后的信號，以此來考察自制庫侖流通池的電化學氧化性能。文章重點闡述了庫侖流通池的構造和電化學性能，但從分析方法的角度來看，該方法是微型液相色譜－柱后電化學衍生－熒光或化學發(fā)光檢測法。文中作者使用自制的電化學流通池，在流速為100μL／min下，目標分析物的轉化率為92.7%～99%，有效電極面積約為1.2cm2，流通池的死體積約為0.5μL。與其它兩種商品化電化學檢測器相比，該裝置具有更高的氧化效率，且將譜峰展寬降至最小。實際樣品的進樣量只需15μL，方法的檢測限為0.3～2.0fmol。作者設計了性能優(yōu)良的電化學流通池，與其前期工作［10］相比，儀器微型化，靈敏度得到提高，但玻碳粉末的填充工作難度較大，操作復雜，這些問題需要改進。

綜上所述，柱后電化學衍生在液相色譜中與熒光檢測器相結合，提高了方法的靈敏度和選擇性，進一步擴大了液相色譜的應用范圍，該方法對其它相關領域的研究者而言具有較為有益的參考價值。但由于液相色譜的分離部分使用的流動相和電化學衍生所需的支持電解液性質在某些方法中存在一定的兼容問題，需要額外的技術來輔助，這樣增加了分析成本，使得分析方法復雜化。另外，在梯度淋洗過程中，為了提高洗脫能力，流動相中的有機成分（如甲醇、乙腈）可能高達100%，以此純有機試劑作為支持電解液，電化學反應難以進行，或者反應效率較低，液相色譜和電化學衍生難以兼容，這是RPHPLC／ED／FD的主要缺點之所在。

3 離子色譜－電化學衍生－熒光檢測技術

離子色譜的特點正好彌補了上述高效液相色譜存在的不足，主要表現(xiàn)為：（1）離子色譜常用的淋洗液為水溶性緩沖鹽體系，如Na2CO3／NaHCO3、NaH2PO4體系，若離子色譜和電化學衍生相聯(lián)用，水溶性淋洗液可作為電化學衍生反應優(yōu)良的支持電解液；（2）由于常用的離子色譜分離柱內填料為有機聚合物基質，能夠在全段pH范圍內使用，這樣彌補了液相色譜只能在酸性條件下分離的缺點。這兩點說明離子色譜和電化學衍生具有較好的兼容性。在此基礎上，設計了兩種電化學衍生裝置，建立了離子色譜－柱后電化學衍生－光學檢測系統(tǒng)來測定極性有機化合物及金屬離子，擴大了離子色譜的應用范圍。

3.1 基于鈦鍍釕電極的電化學衍生裝置的研制及其在離子色譜－電化學衍生－熒光法測定葉酸類物質中的應用

本課題組研制了一個電解池，并第一次作為電化學衍生裝置應用于離子色譜－電化學衍生－熒光法中（IC／ED／FD）［11］。弱熒光性質的葉酸（FA）和甲氨蝶呤（MTX）被作為目標物來考察這個裝置的性能。裝置的結構見圖2。電解池主要是按照鈦鍍釕電極的尺寸進行設計，初步在聚四氟乙烯板塊（70mm×40mm×3mm）按照鈦鍍釕電極的尺寸挖出一槽體，即其體積與電極體積相同，為（49.6mm× 10mm×0.5mm），陰陽極殼體間夾以離子交換膜并以螺絲固定密封。當淋洗液以1.0mL／min的流量流過此裝置時，流體壓力較大且發(fā)生漏液現(xiàn)象，究其原因，是因為電極與槽體內壁，離子交換膜之間機械密閉而無通道供淋洗液流過，使得流體壓力增大，淋洗液向槽體以外其它地方滲漏。

為了解決上述問題，槽體被拓深1mm，即槽體的體積為（49.6mm×10mm×1.5mm），在電極與離子交換膜間有（49.6mm×10mm×1.0mm）的空間?？臻g內填入離子交換樹脂，離子交換樹脂具有導電性、價格便宜、無污染等特點，能起到降低陰陽極室間電阻的作用。實驗中分析物FA和MTX為陰離子形式存在，故采用陽離子交換樹脂作為填充物，以避免分析物在樹脂上面的保留。離子交換膜起到密封裝置和導電的作用，防止漏液現(xiàn)象的發(fā)生。

圖2 自制電解池結構示意圖［11］Figure 2.A schematic diagram of the self－fabricated electrolytic cell.

鈦鍍釕電極也稱金屬陽極，即DSA（dimen－sionally stable anode），具有優(yōu)良的電化學活性和耐蝕性，且不易鈍化，具有較好的化學和電化學穩(wěn)定性，常用在氯堿工業(yè)中做金屬陽極使用［12］。根據文獻［13］報道，貴金屬鍍層電極可以克服電化學氧化的極限電勢，能降低反應的活化能。這些說明鍍釕涂層電極可能對電化學反應具有催化作用。以此電極作為工作電極，電解池的電化學氧化效率為22.4%。一般而言，安培流通池的轉化率為1%～5%，而庫侖流通池近100%［8］。Iwasaki等［14］使用扇形陣列電極作工作電極，制作了一個安培檢測器。當流速為0.01mL／min時，電化學轉化率可達到94%，但當流速為1.0mL／min時，其轉化率在10%以下，低于本工作所設計的電解池的轉化率?？赡艿脑蛴袃牲c：（1）本裝置所用的工作電極面積（49.6mm×10mm）大于所報道工作電極（內徑為4mm）；（2）本工作所用的鈦鍍釕電極具有一定的電化學催化作用，使得電解池的電化學轉化率較高，以達到對目標分析物的靈敏檢測。FA和MTX的檢測限分別為1.8和2.1μg／L。利用本方法對類風濕患者血漿中的FA和MTX含量進行分析，同時也分析了大B細胞淋巴瘤患者尿液中MTX的含量。

3.2 基于多孔電極的電化學衍生裝置的研制及其在IC／ED／FD測定酚類中的應用研究

酚類物質對環(huán)境和水體存在危害，因此對酚類的檢測日益受到重視。如前所述，Karst等利用RPHPLC／ED／FD測定了11種單取代酚，由于需要在柱后添加NH3／NH4Cl（pH＝9.5）緩沖溶液，使得分析程序復雜化。而離子色譜可以在堿性條件下較好地分離酚類物質，電化學衍生和熒光檢測就無需額外的柱后加堿?；谶@個構想，本課題組提出離子色譜－電化學衍生－熒光法測定酚類物質［15］，即以陰離子交換色譜分離酚類，利用自制的電解池作為電化學衍生裝置對酚類物質進行電化學衍生，再以熒光檢測器檢測。

自制的電解池包括多孔電極和陽離子交換膜，結構見圖3。采用多孔鈦板作為電解池的工作電極。早在20世紀80年代，多孔電極已經廣泛地應用于流動系統(tǒng)（如流動注射分析，離子色譜）中的電化學傳感器和檢測器的制造中［16－19］。商品化的多孔鈦板具有價格低廉、化學性質穩(wěn)定等特點，是流動電化學反應中較為優(yōu)良的電極材料。在相同表面積下，多孔電極的有效電極面積是平板電極的4倍。鑒于以上優(yōu)點，多孔鈦板被選作工作電極，這樣酚類的電化學氧化反應不僅在電極表面進行，而且也在電極內部進行。因此，電解池的氧化能力大大增強，檢測靈敏度也得到較大提高。

圖3 基于多孔電極的電解池結構示意圖［15］Figure 3.A schematic diagram of the self－fabricated electrolytic cell based on porous electrode.

戴安公司生產的IonPac AS11分離柱是一種具有相對低容量的分離柱，可以用來快速洗脫簡單樣品基體中的無機陰離子或者有機酸離子。各種酚在15min內能在AS11柱上得到較好分離，具有較好的分離度和峰形。各種酚（全稱詳見文獻［15］）在不同電位下的色譜峰見圖4。

圖4 各種酚（～10mg／L）在不同電壓下色譜圖［15］Figure 4.Chromatograms of phenols（～10mg／L）detection at different potentials.

該方法與文獻報道的其它方法如高效液相色譜－安培檢測法、HPLC／ED／FD［5］法等進行了比較，如表2所示。一般地，直接以電化學檢測具有較高的靈敏度［20］。而與文獻［21］所報道的以H2O2為衍生試劑的化學衍生－熒光檢測法相比，4－乙酰氨基苯酚的檢出限（LOD）要比本方法的LOD高10倍。該方法的LOD和檢測下限（LOQ）均與RP－HPLC／ED／FD［5］的LOD和LOQ在同一數量級，而4－羥基苯乙酸的LOD在本方法中比RP－HPLC／ED／FD低30倍。這些均表明，該方法的靈敏度與高效液相色譜法的相同，甚至比其更靈敏。這主要是因為多孔電極的強氧化能力使得各種酚類能被充分地氧化，同時，電位程序法的使用也使得各種酚的靈敏度大大得到提高。而該方法無疑比RP－HPLC／ED／FD更為簡單。

表2 IC／ED／FD與其它方法的靈敏度比較［15］Table 2 Sensitivity comparison between IC／ED／FD and other methods

在環(huán)境水體中，存在著大量不同種類的酚，這些酚結構類似，一般對目標分析物會形成干擾，給分離和檢測帶來困難。其它酚對目標分析物的干擾現(xiàn)象也被考察。如圖5所示。以IC／UV分析目標物，其它酚類存在較大的干擾，從而嚴重影響測定，而IC／ED／FD法中無干擾存在。這進一步表明了電化學衍生和熒光檢測器的結合，使得該方法具有較好的選擇性。

圖5 以IC／UV和IC／ED／FD法測定酚類的干擾效應圖［15］Figure 5.The interference effects in phenol detection with IC／UV and IC／ED／FD.

3.3 離子色譜－電化學衍生－紫外可見光檢測聯(lián)用裝置的構建

我們初步對離子色譜－柱后電化學衍生－紫外或可見光檢測法進行探討，并設計不同結構類型的電化學衍生裝置，以二價錳（Mn2＋）為目標分析物，來探討電化學衍生的效率、方法的靈敏度等問題。離子色譜－電化學衍生－紫外法具有選擇性好的優(yōu)點，特別是對于以傳統(tǒng)的電導檢測法而言，更具有選擇性。至目前為止，文獻中無相關方法的報道。

圖6 流動注射－在線電化學氧化Mn2＋及色譜圖Figure 6.UV chromatograms of Mn2＋analyzed by flow－injection and after being on－line electrochemical oxidized and.

本課題組試驗了不同的結構，考察每一種結構的電化學氧化效果。第一種結構為兩多孔電極（即陰陽極室）間加一張陽離子交換膜，如圖7（a）所示，由于Mn2＋為陽離子，而Mn2＋的電化學氧化也在陽極室（即多孔電極）內發(fā)生，當施加電位時，Mn2＋在電場力的作用下會選擇性地透過陽離子交換膜電遷移至陰極室，這樣會造成Mn2＋含量的減少，從而影響準確定量分析；第二種結構為兩極室間夾一陰離子交換膜，如圖7（b），這種結構阻擋了Mn2＋的電遷移，經電化學氧化后的紫外信號較（a）有所增加；第三種結構是在陰陽極室間夾兩張離子交換膜，其中陽極緊貼陰離子交換膜，陰極緊貼陽離子交換膜，如圖7（c），此種結構的電解池作為電化學氧化Mn2＋，其信號是（b）的6倍?？赡艿脑蚴且驗樵冢╟）結構中，Mn2＋無法電遷移至陰極室而全部通過陽極室，此時起始反應物濃度高于前兩種結構中的起始反應物濃度，故氧化產物濃度亦較前兩者高。

圖7 電解池的不同結構類型對可見光信號的影響Figure 7.Effects of the different structures of electrolytic cells on UV signals.

4 結語

柱后電化學衍生技術目前較多地應用于以反相鍵合相色譜為主的RP－HPLC系統(tǒng)中。但由于RPHPLC使用的流動相具有較窄的pH值范圍和較高比例的有機試劑含量，與電化學衍生技術往往難以兼容。離子色譜使用有機聚合物為基質的離子交換柱，可以使用全pH值范圍的水溶性緩沖鹽作為流動相。這樣使得離子色譜和電化學衍生系統(tǒng)具有較好的兼容性，離子色譜分離系統(tǒng)和柱后電化學衍生技術相結合，提高了方法的靈敏度和選擇性。本課題組設計了兩種電化學衍生裝置，建立了離子色譜－柱后電化學衍生系統(tǒng)來測定極性有機化合物和金屬離子，進一步擴大了液相色譜的應用范圍。提高方法的靈敏度及擴大被分析物范圍是液相色譜－柱后電化學衍生系統(tǒng)的發(fā)展方向。

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Progress of Liquid Chromatography－post－column Electrochemical Derivatization and Optical Detection

WU Shuchao1，2，3，ZHANG Jiajie3，ZHOU Danchun4，ZHENG Cunjiang2，ZHU Yan3＊

（1.ChinaUniversityofGeosciences（Wuhan），Wuhan430074，China；2.ZhejiangInstituteofGeology＆MineralResources，Hangzhou310007，China；3.DepartmentofChemistry，ZhejiangUniversity，Hangzhou310028，China；4.HospitalofZhejiangUniversity，Hangzhou310027，China）

This paper reviewed the progress of reversed phase high performance liquid chromatographypost－column electrochemical derivatization－fluorescence detection（RP－HPLC／ED／FD），and the major problems of RP－HPLC／ED／FD were discussed.The progress of ion chromatography－post－column electrochemical derivatization－optical detections，as well as the applications for the determination of organic compounds and metal ions were also reviewed.

RP－HPLC；electrochemical derivatization；fluorescence；IC

O657.7＋5；TH833

A

2095－1035（2012）03－0001－07

10.3969／j.issn.2095－1035.2012.03.001

2012－07－01

2012－07－31

浙江省自然科學基金（Y4090268，LY12B05003）。

吳述超，男，博士，主要從事化學分析工作。E－mail：shuchaowucn＠gmail.com

＊通訊作者：朱巖，教授，博士生導師，主要從事離子色譜研究工作。E－mail：zhuyan＠zju.edu.cn