櫛孔扇貝（Chlamys farreri）殼頂幼蟲血細胞分布的免疫學觀察＊

倪永慶，邢 婧，林聽聽，戰(zhàn)文斌

（中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東青島266003）

血細胞是貝類免疫防御系統(tǒng)重要的組成部分，可參與炎癥、傷口修復、呼吸爆發(fā)、吞噬和包囊等作用［1］。1960－1970年代，研究者們主要對貝類血細胞分類和結(jié)構(gòu)進行研究；1980年代以后，貝類血細胞的免疫防御功能備受關(guān)注［2－4］。近年來，貝類血細胞的發(fā)生和分化開始成為研究熱點，研究者們多采用單克隆抗體對貝類血細胞進行組織定位，在應用抗血細胞單克隆抗體對紫貽貝（Mytilus edulis）各期胚胎幼蟲研究中發(fā)現(xiàn)在第1～4天的幼蟲出現(xiàn)了血細胞［5］；在牡蠣（Ostrea edulis）中應用抗顆粒細胞單克隆抗體發(fā)現(xiàn)了其顆粒細胞出現(xiàn)在第30～32天牡蠣幼蟲鰓的結(jié)締組織和上皮細胞之間［6］。研究組在制備出抗櫛孔扇貝（Chlamys farreri）血細胞的單克隆抗體的基礎(chǔ)上，應用單克隆抗體定位了櫛孔扇貝稚貝的造血組織［7］；并發(fā)現(xiàn)血細胞出現(xiàn)在D形幼蟲期，數(shù)量較少，分布僅局限于消化器官周圍［8］。相比于D形幼蟲，殼頂幼蟲的細胞與組織分化快，消化器官、循環(huán)系統(tǒng)等發(fā)育更加完善，功能增強。本文采用半薄切片的組織化學染色法和單克隆抗體的免疫組化方法、免疫電鏡方法，研究櫛孔扇貝D形幼蟲期后的殼頂幼蟲血細胞的形態(tài)特征與分布特點，以期為研究和闡明扇貝各發(fā)育階段血細胞的發(fā)生與分化積累資料。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

櫛孔扇貝殼頂幼蟲采集于山東尋山水產(chǎn)集團海珍品綜合養(yǎng)殖場，經(jīng)顯微鏡測量其殼長×殼高為（125～156）μm×（105～138）μm［9］。采集的殼頂幼蟲樣品經(jīng)2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，經(jīng)梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，聚合，超薄切片機連續(xù)切片。半薄切片厚度為2μm，脫去樹脂［10］，用于愛氏蘇木精與曙紅染色（H＆E染色）與免疫組化；超薄切片厚度為70 nm，用于免疫電鏡。

免疫組化所用的第一抗體為四株抗櫛孔扇貝血細胞單克隆抗體（1E7，1F12，2C6，2 H5）的混合抗體，由本實驗室研制［11］。生物素化馬抗小鼠IgG（H＋L）、堿性磷酸酶標記鏈親和素、堿性磷酸酶底物AP－Red試劑盒購自北京中杉金橋生物公司，膠體金（SPA）標記羊抗小鼠IgG購自SIGMA公司，金顆粒直徑為10 nm。牛血清蛋白（BSA）購自AMRESCO公司。鋨酸及環(huán)氧樹脂（Epon－812）購自SERVA公司。

1.2 方法

1.2.1 H＆E染色與免疫組化 將半薄切片置于愛氏蘇木精染液內(nèi)，60℃染色1 h，蒸餾水沖洗1 min，1%曙紅染10 min，蒸餾水沖洗，50%緩沖甘油封片，顯微鏡（OLYMPUS BX－51）觀察，拍照。用于免疫組化的半薄切片，首先加0.3%乙酸室溫孵育10 min，以抑制內(nèi)源酶活性，然后用含0.1%Tween－20的0.01 mol·L－1磷酸鹽緩沖液（PBST，p H＝7.4）浸洗5 min；加5%牛血清白蛋白孵育室溫封閉30 min；加抗櫛孔扇貝血細胞混合單克隆抗體為第一抗體，37℃孵育1 h，PBST浸洗3次，每次5 min；然后加生物素化馬抗小鼠IgG（稀釋比例1∶600），37℃孵育45 min，PBST浸洗3次，每次5 min；再加堿性磷酸酶標記鏈親和素（稀釋比例1∶500），37℃孵育45 min，PBST浸洗3次，每次5 min。最后，以堿性磷酸酶底物AP－Red試劑盒底物發(fā)色5 min，蒸餾水沖洗，蘇木精襯染3 min，0.1%HCl酒精分色，蒸餾水沖洗，藍化，伊文思藍再次襯染2 min，蒸餾水沖洗，50%緩沖甘油封片，顯微鏡觀察，拍照。陰性對照以骨髓瘤細胞（P3U1）培養(yǎng)液上清液代替混合抗體作為第一抗體。

1.2.2 免疫電鏡 超薄切片經(jīng)1%H2O2處理30 min以暴露抗原，之后以超純水清洗；5%BSA封閉30 min，加入混合抗體為第一抗體，37℃孵育1 h，PBST浸洗3次，每次5 min；加入膠體金標記羊抗小鼠IgG（稀釋比例1∶100）為第二抗體，37℃孵育1 h，PBST浸洗3次，每次5 min，再以超純水浸洗3次，每次3 min，自然晾干；經(jīng)5%醋酸鈾染20 min，超純水洗3次，每次3 min；枸櫞酸鉛染色15 min，超純水充分洗凈；干燥后在JEM－1200EX型透射電子顯微鏡下觀察，拍照。陰性對照以P3U1代替混合單抗作為一抗。

2 結(jié)果

2.1 H＆E染色觀察

半薄切片H＆E染色觀察發(fā)現(xiàn)，櫛孔扇貝殼頂幼蟲組織器官分化清晰，界限明顯。外緣為外套膜，內(nèi)臟團包括面盤、口、消化道、胃、消化腺、足等（見圖1A）。面盤收縮于外套膜內(nèi)，表面具有密集的纖毛?？谖挥诿姹P一側(cè)，連接著狹隘而短的食道。胃與食道相連，為膨大的囊狀，約占幼蟲體積的1／3，可見胃腔內(nèi)食物。消化腺圍繞在胃和消化道附近。足位于內(nèi)臟團的一側(cè)，呈橢圓形。幼蟲體內(nèi)細胞以成簇或游離狀分布，呈圓形或橢圓形，直徑為3～5μm，H＆E染色細胞核呈藍紫色，細胞質(zhì)呈暗紅色（見圖1B）。游離的細胞數(shù)目少，成簇分布的細胞數(shù)量多，大小不一，聚集分布于外套膜、面盤、食道、消化腺、胃等處。

圖1 櫛孔扇貝（Chlamys farreri）殼頂幼蟲的H＆E染色結(jié)果Fig.1 H＆E staining observation of umbolarvae in Chlamys farreri

2.2 免疫組化觀察

半薄切片免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性信號（紅色沉淀）出現(xiàn)在殼頂幼蟲的外套膜、面盤、食道、消化腺、胃等組織器官內(nèi)的細胞中，陽性細胞清晰可辨，直徑為3～5μm，細胞質(zhì)呈紅色，細胞核呈藍色，說明該時期幼蟲體內(nèi)血細胞分布廣泛（見圖2A）。根據(jù)陽性細胞的分布可見，外套膜組織內(nèi)的血細胞散在分布，呈梭形或橢圓形；在面盤頂部與食道附近有少量游離血細胞的存在；在面盤基部、消化腺和胃的周圍血細胞數(shù)量多，大小不一，形態(tài)多樣，并且相互聚集成簇。陰性對照無陽性信號出現(xiàn)（見圖2B）。本結(jié)果與H＆E染色觀察的細胞分布特點相似，證實所觀察的細胞主要為血細胞。

2.3 免疫電鏡觀察

免疫電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膠體金顆粒結(jié)合的血細胞分布在殼頂幼蟲的外套膜、面盤、食道、消化腺、胃等組織器官內(nèi)。血細胞直徑3～5μm，呈不規(guī)則狀。細胞核多位于細胞一側(cè)，常染色質(zhì)電子密度低，異染色質(zhì)電子密度高，分布于核周緣和常染色質(zhì)之間。細胞質(zhì)電子密度相對低，可見線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器以及空泡。不同組織中，血細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)略有差異：消化腺組織內(nèi)的血細胞，密集而擠壓，細胞邊緣不規(guī)則，細胞核呈腎形或不規(guī)則狀，胞質(zhì)內(nèi)有多個線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，核質(zhì)比高（見圖3A）。面盤組織內(nèi)的血細胞，呈多邊形，細胞核橢圓形，胞質(zhì)內(nèi)細胞器較少，僅有少量線粒體，核質(zhì)比低（見圖3B）；在血細胞內(nèi)均可見大小一致、電子密度高而清晰的圓形膠體金顆粒，膠體金顆粒多呈點狀分布在血細胞的細胞質(zhì)以及核質(zhì)交界區(qū)域，在細胞核與細胞膜也有少量膠體金顆粒的分布。

3 討論

本文通過半薄切片H＆E染色法和單克隆抗體的免疫組化、免疫電鏡法定位櫛孔扇貝殼頂幼蟲的血細胞，觀察血細胞的分布特點。結(jié)果表明，櫛孔扇貝殼頂幼蟲外套膜、面盤、口、食道、消化腺、胃、足等組織器官分化清晰；殼頂幼蟲的外套膜、面盤、食道、消化腺、胃等組織器官內(nèi)及周圍廣泛分布著血細胞，其中面盤、消化腺、胃等處有大量血細胞聚集成簇。

研究組前期應用單克隆抗體的免疫組化方法研究櫛孔扇貝血細胞的胚胎發(fā)生時相，在囊胚期、原腸胚期、擔輪幼蟲期均未出現(xiàn)陽性信號，陽性信號出現(xiàn)于D形幼蟲期，但該時期血細胞數(shù)量較少，分布也比較局限，僅分布于幼蟲消化組織器官周圍，血細胞內(nèi)部形態(tài)不易分辨［8］。與D形幼蟲相比，殼頂幼蟲的陽性信號明顯增強，分布位點也明顯增多，說明大量血細胞已經(jīng)出現(xiàn)在殼頂幼蟲體內(nèi)，并且廣泛分布于外套膜、面盤、食道、消化腺、胃等器官，其形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰可辨，胞質(zhì)內(nèi)含有多個線粒體。血細胞在消化食物、吞噬異物和降解廢物過程中需要大量能量，可推測血細胞參與幼蟲營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、消化和運輸?shù)裙δ堋?/p>

在組織形態(tài)學研究方面，多采用石蠟切片，但由于本實驗中櫛孔扇貝（殼頂幼蟲）個體較小，殼長僅為125～156μm，前期工作用石蠟包埋切片厚度在5～7μm之間，染色后觀察發(fā)現(xiàn)細胞重疊多，無法清晰地觀察到殼頂幼蟲的組織結(jié)構(gòu)和血細胞的內(nèi)部形態(tài)。半薄切片是經(jīng)環(huán)氧樹脂包埋，厚度在1～2μm的薄片，在高倍鏡下視野清楚，細胞重疊少，結(jié)構(gòu)清晰度高，細胞界限分明，而且半薄切片是電鏡超薄切片技術(shù)中一種有效的定位方法。但該方法不能定性地研究血細胞除分布以外的其它特點，而且僅僅用H＆E染色觀察不足以證明所觀察到的細胞為血細胞，這需要借助抗櫛孔扇貝血細胞的單克隆抗體，在幼蟲中原位定位血細胞，以獲得充足的證據(jù)。因此，本研究采用半薄切片H＆E染色法和免疫組化方法觀察殼頂幼蟲的組織結(jié)構(gòu)，并原位定位血細胞的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)殼頂幼蟲已經(jīng)分化出界限清晰的組織器官，并且發(fā)現(xiàn)與消化功能相關(guān)的組織器官內(nèi)及周圍廣泛分布著血細胞。同時，本研究采用免疫電鏡方法進一步定位觀察幼蟲體內(nèi)各組織中血細胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組織內(nèi)血細胞形狀不規(guī)則，直徑為3～5μm，細胞核多位于細胞的一側(cè)，多為圓形或橢圓形，常染色質(zhì)電子密度低，異染色質(zhì)電子密度高，分布于核周緣和常染色質(zhì)之間，細胞質(zhì)內(nèi)含有線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器和空泡。本研究采用半薄切片H＆E染色、免疫組化和超薄切片免疫電鏡方法互相對照，更加詳盡地解析殼頂幼蟲組織結(jié)構(gòu)與血細胞分布的特點。

免疫組化結(jié)果基本印證了半薄切片H＆E染色結(jié)果中血細胞的分布特點，但略有不同，免疫組化結(jié)果并非所有的血細胞都顯示為陽性。究其原因，第一種可能是因為經(jīng)環(huán)氧樹脂包埋，高溫聚合、脫樹脂等處理，雖然保證了樣品的形態(tài)結(jié)構(gòu)，但高溫聚合對細胞的影響較大，容易出現(xiàn)細胞漿破壞、核破裂等現(xiàn)象，不可避免使樣品抗原決定簇受到破壞；第二種可能是因為櫛孔扇貝血細胞的單克隆抗體是抗成熟血細胞某一特定抗原決定簇，而殼頂幼蟲組織中血細胞處于發(fā)生、分化和未成熟階段，其抗原決定簇的類型和數(shù)量與成熟血細胞稍有差異；第三種可能是因為切片的角度或厚度并未暴露其相應的抗原決定簇所致。

有關(guān)櫛孔扇貝血細胞的研究報道都集中于成體，但關(guān)于幼蟲的研究較少。研究組前期對櫛孔扇貝的成貝血細胞形態(tài)及其分類作了初步研究，并且初步定位了櫛孔扇貝稚貝的造血組織［12，7］。本研究未發(fā)現(xiàn)到櫛孔扇貝殼頂幼蟲中顆粒血細胞和透明血細胞的類型分化，以及類似稚貝造血組織的結(jié)構(gòu)。今后可進一步通過不同類型血細胞的單克隆抗體對不同時期幼蟲血細胞的發(fā)生、分化和成熟過程進行深入地研究。

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