紅豆杉內(nèi)生放線菌的分離及活性菌株的篩選與鑒定

張 曼， 解修超，2， 陳文強，2， 鄧百萬＊，2， 張曉偉， 孔亞男

（1.陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001；2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723001）

紅豆杉內(nèi)生放線菌的分離及活性菌株的篩選與鑒定

張 曼1， 解修超1，2， 陳文強1，2， 鄧百萬＊1，2， 張曉偉1， 孔亞男1

（1.陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001；2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723001）

通過組織勻漿法分離紅豆杉（Taxus chinensis）根、莖、葉3個部位的內(nèi)生放線菌，采用濾紙片法初步研究了內(nèi)生放線菌發(fā)酵液的抑菌活性，并對抑菌活性明顯的菌株進行了分子鑒定。結(jié)果表明，分離純化得到內(nèi)生放線菌55株，抑菌活性試驗中共有21株表現(xiàn)出了不同程度的拮抗作用，占全部分離菌株的38.2%，其中4株具有明顯的抑菌活性。經(jīng)16S r DNA序列分析，初步鑒定3株為鏈霉菌屬（Streptomycessp.），1株為小單孢菌屬（Micromonosporasp.）。

紅豆杉；內(nèi)生放線菌；分離；篩選；鑒定

植物與微生物之間存在著一種復(fù)雜的微生態(tài)關(guān)系，在這個微生態(tài)中發(fā)揮重要作用的成員之一是植物內(nèi)生菌，主要包括真菌、細菌和放線菌。植物內(nèi)生放線菌（Endophytic Actinomycetes）是指存活于健康植物組織內(nèi)部，而又不引發(fā)（至少暫時不引發(fā)）宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的放線菌［1］。這一類放線菌資源多樣，在與宿主植物長期的“協(xié)同進化”中可能會在為宿主提供保護，抵御外來其它微生物的侵害等方面發(fā)揮作用，而且部分可以產(chǎn)生與宿主相同或相似的次生代謝產(chǎn)物。

近年來，國內(nèi)外研究人員開展了大量有關(guān)植物內(nèi)生放線菌的研究，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的活性物質(zhì)種類極其豐富，主要包括抗生素、有機酸、氨基酸、維生素、甾體、酶及酶抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑等［2－4］。Birber［5］等從歐洲榿木根瘤分離到一株鏈霉菌可產(chǎn)生新的萘醌類抗生素，抑菌研究表明對革蘭氏陽性菌有活性，對革蘭氏陰性菌則無活性，對k562人白血病細胞有細胞毒性；Strobel［3］等從肯尼迪黑質(zhì)蛇紋樹中分離到一株能產(chǎn)生廣譜抗生素Munumbicins的鏈霉菌，對耐藥性細菌及瘧原蟲有抑制作用。另外，我國的秦盛［6］、古強［7］等人也開展了植物內(nèi)生放線菌在拮抗活性方面的研究。

藥用植物中因含有多種活性成分而受到廣泛關(guān)注，其中的內(nèi)生菌可能與宿主植物之間存在著更為特殊的關(guān)系。劉寧［8］等對云南西雙版納多種藥用植物中的內(nèi)生放線菌進行了抗菌和抗腫瘤研究，并從放線菌的發(fā)酵液中找到了6種化合物，其中1種為新化合物。2009年鄭法新［9］等人從云南紅豆杉（Taxus yunnanensis）根部分離到一株內(nèi)生放線菌TAR11，其發(fā)酵液對多種植物病原菌均有抑制作用。我國藥用植物資源豐富，為尋找新的放線菌資源以及活性物質(zhì)提供了極大的可能性。

紅豆杉（Taxus chinensis）為紅豆杉科（Taxaceae）紅豆杉屬（Taxus）植物，是含有抗癌藥物紫杉醇的珍稀裸子植物，全世界共分布有11種，我國有4種和1個變種［10］。目前，有關(guān)紅豆杉內(nèi)生菌的研究主要集中在內(nèi)生真菌［11－12］方面，而紅豆杉內(nèi)生放線菌的研究報道尚少。本研究以采自秦嶺山區(qū)的紅豆杉（Taxus chinensis）為材料，分離其內(nèi)生放線菌，并對抗菌活性菌株進行篩選以及初步鑒定，以期為植物內(nèi)生放線菌的利用與開發(fā)提供方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料紅豆杉（Taxus chinensis）采自陜西佛坪國家自然保護區(qū)。

1.1.2 靶標(biāo)菌株大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、白色念珠菌（Monilia albican），均由陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.3 培養(yǎng)基分離培養(yǎng)基：改良高氏一號培養(yǎng)基（可溶性淀粉20.0 g，KNO31.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂粉15.0 g，加水至1 000 m L，p H 7.2～7.4）、改良高氏二號培養(yǎng)基（葡萄糖1.0 g，蛋白胨0.5 g，胰蛋白胨0.3 g，NaCl 0.5 g，復(fù)合維生素0.5 g，瓊脂粉15 g，加水至1 000 m L，p H 7.2～7.4）、海藻糖－脯氨酸培養(yǎng)基（海藻糖5.0 g，脯氨酸1.0 g，（NH4）2SO41.0 g，NaCl 1.0 g，CaCl22.0 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7 H2O 1.0 g，瓊脂粉15 g，加 水 至 1 000 m L，p H 7.2～7.4）和 1／10 ATCC172培養(yǎng)基（葡萄糖1.0 g，可溶性淀粉2.0 g，酵母浸汁0.5 g，CaCO31.5 g，N－Z－Amine A 0.5 g，瓊脂粉 15 g，加水至 1 000 m L，p H 7.2～7.4）［13］。各分離用培養(yǎng)基中均加入重鉻酸鉀75.0 mg／L，制霉菌素100 mg／L，萘啶酮酸20 mg／L，用以抑制雜菌生長［14］。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏－麥芽汁培養(yǎng)基（酵母粉4 g，麥芽浸提物5 g，葡萄糖4 g，瓊脂粉15 g，加水至1 000 m L，p H 7.2～7.4）。

1.2 方法

1.2.1 分離取新鮮的紅豆杉組織，在加有洗滌劑的水中浸洗10 min，去除表面泥沙，然后自來水沖洗2 h左右。在超凈工作臺中，依次為無菌水沖洗3次，體積分數(shù)75%乙醇浸泡45 s，無菌水沖洗3次，0.1%HgCl2浸泡5 min，無菌水沖洗5次。無菌解剖刀取根、莖韌皮部組織以及葉片各約5 g分別剪碎置于研缽中，各加45 m L無菌水充分研磨，取100μL勻漿涂布于各分離培養(yǎng)基，置于28℃下培養(yǎng)15～30 d。待有菌長出后，采用平板劃線純化直至為單菌落，挑取菌絲于甘油管中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 表面消毒可靠性的檢驗取最后一次沖洗用的無菌水100μL涂布于各分離培養(yǎng)基，28℃下培養(yǎng)30 d，檢查消毒效果。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)將純化好菌株接種于50 m L酵母膏－麥芽汁培養(yǎng)基中，28℃，160 r／min發(fā)酵7 d。10 000 r∕min離心20 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后將所得濾液4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 抗菌活性測定采用濾紙片擴散法［15］測定全部分離菌株發(fā)酵液對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌的拮抗作用。

1.2.5 菌株鑒定在1／10 ATCC172培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)抗菌活性明顯的菌株10 d，觀察其菌落形態(tài)及培養(yǎng)特征。采用溶菌酶－SDS法［16］提取抗菌活性明顯菌株的總DNA。以細菌通用引物27F：（5′－AGA GTTTGATC－CTGGCTCAG－3′）和 1492R（5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′） 擴 增 其16S r DNA 序列。PCR反應(yīng)體系（25.0μL）：2×Taq PCR Mix 12.0μL，10.0μmol∕m L的引物各1.0μL，DNA 模板2.0μL，滅菌雙蒸水9.0μL。PCR反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃1 min，56℃1 min，72℃2 min，30個循環(huán)；72℃10 min。用1.0 g／d L的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，由上海桑尼生物科技有限公司進行雙向測序。將所測序列提交到NCBI進行Blast檢索，下載同源性較高的數(shù)據(jù)，生成Fasta格式的文件。用Clusta－X軟件對所得序列進行人工校正及比對分析。利用Mega5，按照N－J法聚類，選擇1 00個重復(fù)做Bootstrap值分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 表面消毒的可靠性

在用最后一次沖洗用無菌水涂布的平板上，28℃下培養(yǎng)30 d，未見有放線菌菌落長出。由此證明，經(jīng)分離并多次純化后得到的放線菌均為紅豆杉內(nèi)生放線菌。

2.2 紅豆杉內(nèi)生放線菌的分離

經(jīng)表面消毒、采用組織勻漿法進行了4次內(nèi)生放線菌，經(jīng)過純化，按菌落形態(tài)，借助顯微鏡，排除重復(fù)，共得到放線菌55株（如表1）。

表1 紅豆杉不同組織部位分離得到的內(nèi)生放線菌Tab.1 Different tissues of endophytic actinomycete from Taxus chinensis

表1結(jié)果所示，紅豆杉3個部位中內(nèi)生放線菌的分布數(shù)量依次為根＞莖＞葉，可見根為紅豆杉內(nèi)生放線菌分布最多的部位。從根中分離到32株，占分離菌株總數(shù)的58.2%；莖中分離到15株，占分離菌株總數(shù)的27.3%；葉中僅分離到8株，占分離菌株總數(shù)的14.5%。

2.3 分離菌株的抗菌活性

采用濾紙片擴散法對55株內(nèi)生放線菌的發(fā)酵液進行抗菌活性研究，有21株表現(xiàn)出了不同程度的拮抗活性，占全部分離菌株的38.2%（如表2）。

表2 紅豆杉內(nèi)生放線菌對靶標(biāo)菌的的拮抗作用Tab.2 Antagonistic action of endophytic actinomycete from Taxus chinensis

表2結(jié)果所示，在具有抗菌活性的分離菌株中，以TA17、TA25和TA45的抗菌譜最廣，對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和白色念珠菌均有活性，其中對前兩種靶標(biāo)菌的抑制作用明顯，抑菌圈直徑達27.0 mm。此外，實驗中發(fā)現(xiàn)，TA42除了對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有抑制活性之外，對白色念珠菌的拮抗活性屬所有菌株發(fā)酵液中最強，抑菌圈直徑為21.0 mm。能拮抗沙門氏菌活性菌株最少，僅為4株，占全部活性菌株總數(shù)的7.3%，所有菌株均對銅綠假單胞菌不表現(xiàn)抗菌活性。

2.4 抗菌活性菌株的鑒定

經(jīng)過抗菌活性測定，55株內(nèi)生放線菌中共有21株表現(xiàn)出了不同程度的拮抗作用，依據(jù)抑菌圈直徑大小，篩選出4株具有較強抗菌活性的菌株進行了形態(tài)特征觀察和16S r DNA基因序列分析，菌株編號分別為：TA17、TA25、TA42和 TA45。

2.4.1 形態(tài)特征觀察在1／10 ATCC172培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)10 d后，菌落形態(tài)、基內(nèi)菌絲體生長、氣生菌絲體及可溶性色素各有不同（如表3）。

表3 4株內(nèi)生放線菌的形態(tài)分類Tab.3 Morphological classification of 4 endophytic actinomycetes

依據(jù)《放線菌分類基礎(chǔ)》［17］進行形態(tài)分類，初步將菌株TA17、TA42和TA45歸為鏈霉菌屬（Streptomyces）；TA25歸為小單孢菌屬（Micromonospora）。

2.4.2 16S r DNA基因序列分析對菌株TA17、TA25、TA42和TA45進行總DNA的提取、16S r DNA基因的PCR擴增和雙向測序。根據(jù)16S r DNA基因序列，利用 Mega5，按照N－J法聚類，選擇1 000個重復(fù)做Bootstrap值分析，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（如圖1）。

圖1結(jié)果所示，4個菌株與相應(yīng)模式菌株的相似度均在98%以上。其中TA17、TA25和TA45分別與已發(fā)表菌株Streptomyces flaveus、Micromonospora endolithica和Streptomyces carpaticus聚類在同一個分支上，相似度最高；TA42與Streptomyces chryseus、Streptomyces roseogriseus的親緣關(guān)系最為相近。基于形態(tài)特征和16S r DNA序列分析，初步確定TA17、TA42和TA45為鏈霉菌屬（Streptomycessp.）的已知種，TA25為小單孢菌屬（Micromonosporasp.）的已知種。

3 結(jié)語

從植物中分離放線菌，材料消毒與雜菌抑制劑的選擇是決定分離成敗的關(guān)鍵步驟，植物表面及組織內(nèi)通常附著有比較多的真菌和細菌，培養(yǎng)時會快速布滿整個平板，不利于放線菌的分離。實驗表明，本實驗確定的消毒時間及抑制劑濃度能有效阻止雜菌污染，當(dāng)然這也跟植物材料的樹齡及致密程度有關(guān)。

由于植物內(nèi)生放線菌來自獨特的生存環(huán)境而成為人們尋找新的放線菌資源和活性物質(zhì)的重要來源，目前關(guān)于此類微生物的分離與拮抗菌株篩選已成為抗生素、生物防治等領(lǐng)域研究與開發(fā)的一項重要工作。本研究共分離得到55株內(nèi)生放線菌，自根部所分離到的菌株有32株，占分離菌株總數(shù)的38.2%，明顯高于莖部和葉部，與 Thongchai Taechowisan［18］等人從不同組織中內(nèi)生放線菌的分離數(shù)量與所占比例基本一致，這可能與根部最為接近放線菌的大本營－土壤有關(guān)，為放線菌入侵植物皮層提供了便利?；钚詫嶒烇@示，（1）55株內(nèi)生放線菌發(fā)酵液中有38.2%的分離菌株顯示出了不同程度的抗菌活性，略高于朱文勇［19］等人對喜樹內(nèi)生放線菌的抗菌活性測定結(jié)果，可見利用植物內(nèi)生放線菌在篩選新穎抗生素方面具有較強的潛在價值。（2）數(shù)據(jù)統(tǒng)計表明，能拮抗細菌的內(nèi)生放線菌比拮抗真菌的多，其中拮抗革蘭氏陽性菌（G＋）的內(nèi)生放線菌明顯比拮抗革蘭氏陰性菌（G－）的多，這與大多數(shù)土壤放線菌的總體活性結(jié)果一致。另外有3株鏈霉菌（Streptomycessp.）和1株小單孢菌（Micromonosporasp.）的發(fā)酵液對供測試的4種靶標(biāo)細菌和1種靶標(biāo)真菌均表現(xiàn)出了較強的抑制作用，具有作為抗生素生產(chǎn)菌的潛力，但其產(chǎn)生的抗生素類物質(zhì)結(jié)構(gòu)與作用機理有待進一步研究。

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Isolation，Screening and Identification of Endophytic Actinomycets fromTaxus Chinensis

ZHANG Man1，XIE Xiu－chao1，2，CHEN Wen－qiang1，2，DENG Bai－wan＊1，2，ZHANG Xiao－wei1，KONG Ya－nan1
（1.School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723001，China；2.Shaanxi Engineering Research Center of Edible and Medicated Fungi，Hanzhong 723001，China）

In this manuscript，endophytic actinomycetes were isolated from the root，stem and leaf ofTaxus chinensisby the method of tissue homogenate.Antimicrobial activities of endophytic actinomycetes fermentation broth were determined with filter paper and molecular identification of some potential strains were also carried out.The result indicated that 55 strains of endophytic actinomycetes were isolated，21 of them have varied antimicrobial activity，accounting for 38.2%of all strains and 4 strains have higher antimicrobial activity.Results of 16S r DNA gene sequences analysis of the 4 strains showed that 3 of them belong toStreptomycessp.，1 belongs toMciromonosporasp..

taxus chinensis，endophytic actinomycetes，isolation，screening，cation

Q 939.9

A

1673－1689（2012）05－0549－06

2011－05－11

陜西省重點實驗室資助項目（08JZ21）；陜西省教育廳科研基金項目（08JK248，08JK244）；陜西理工學(xué)院科研基金項目（SLGQD0712，SLGQD0713）。

＊

鄧百萬（1963－），男，陜西漢中人，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事微生物資源保護與開發(fā)利用研究。E－mail：Dengbw2008＠yahoo.com.cn