多種致病菌同步檢測方法的研究進(jìn)展

孫秀蘭， 張 芳， 張銀志

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

多種致病菌同步檢測方法的研究進(jìn)展

孫秀蘭1，2， 張 芳1，2， 張銀志1

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

概述了致病菌檢測的對象，包括細(xì)菌菌群的形態(tài)及細(xì)菌本身、細(xì)菌的DNA、細(xì)菌的代謝物；同時介紹了可同步檢測多種致病菌的方法，主要有電化學(xué)DNA傳感器、適配體電化學(xué)傳感器、免疫傳感器檢測技術(shù)、多重PCR檢測、表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測；最后總結(jié)檢測方法未來的發(fā)展方向。

多種致病菌；同步檢測

多種致病菌相互混合存在于食品中，他們數(shù)量相差很大，難以分離，檢測困難。并且由于食品營養(yǎng)成分的不同，適宜生長的致病菌的種類也不同，如海產(chǎn)品中容易生長副溶血性弧菌。傳統(tǒng)致病菌檢測主要檢測食品中的主要致病菌，但是食品中數(shù)量極少的致病菌也可能對人體健康造成很大影響。牛奶中的主要致病菌是金黃色葡萄球菌［1］，但是2012年2月17日，在美國76人因飲用生奶感染彎曲桿菌［2］。因此，檢測食品中的主要致病菌已經(jīng)不能保障食品安全，多種致病菌的同步檢測提上日程。目前多種致病菌同步檢測的方法主要有：多重PCR檢測、生物傳感器檢測、表面拉曼光譜檢測等方法。本文對多種致病菌同步檢測方法進(jìn)行歸納，并對未來檢測技術(shù)的研究提供一定的參考［3－4］。

1 致病菌檢測的對象

致病菌是指能引起疾病或能造成損傷的微生物，一般所說的致病菌指的是病原微生物中的細(xì)菌。常見致病菌有沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和致瀉大腸埃希氏菌，副溶血弧菌、李斯特菌等等。一般的檢測方法的檢測對象是細(xì)菌菌群的形態(tài)及細(xì)菌本身、細(xì)菌的DNA、細(xì)菌的代謝物［5］。

1.1 致病菌菌群的形態(tài)及細(xì)菌本身

單個細(xì)菌細(xì)胞在電鏡下的形態(tài)會有一定的差異，不同細(xì)菌形成的菌落也會形成不同的形狀。利用他們之間的不同可以對細(xì)菌進(jìn)行初步的鑒定，其中按形態(tài)劃分有球菌、桿菌、弧菌等；在不同的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，又會出現(xiàn)透明或不透明菌落，甚至產(chǎn)生不同顏色。如金黃色葡萄球菌在電鏡下，直徑約0.8μm左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀，無芽胞、鞭毛，大多數(shù)無莢膜［6］。

1.2 致病菌的DNA

脫氧核糖核酸（DNA）是遺傳物質(zhì)，以引導(dǎo)生物發(fā)育與生命機(jī)能運(yùn)作，主要功能是長期性的信息儲存，同時指導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)其他的化合物，如蛋白質(zhì)的合成；也指導(dǎo)其他代謝產(chǎn)物如各種細(xì)菌毒素的合成。以DNA為檢測目標(biāo)物的方法，主要的依據(jù)是堿基互補(bǔ)配對原理，A－T，C－G。一般細(xì)菌都具有種屬DNA，也可檢測編碼特定代謝產(chǎn)物的堿基序列，如編碼金黃色葡萄球菌腸毒素B的基因［7－8］。

1.3 致病菌的代謝物

致病菌的代謝物有很多種，如分泌的毒素、蛋白質(zhì)、酶類等。細(xì)菌的大多數(shù)產(chǎn)物具有抗原特性，有特定的抗體。代謝產(chǎn)物都具有一定的特性，能根據(jù)這些特性來檢測。如金黃色葡萄球菌分泌的凝血酶會產(chǎn)生凝血現(xiàn)象；適配體能與代謝分子特異性結(jié)合，如已經(jīng)篩選出與黃曲霉毒素特異性結(jié)合的適配體［9－10］。

2 多種致病菌同步檢測的檢測方法

2.1 電化學(xué)傳感器

最早的電化學(xué)傳感器可以追溯到20世紀(jì)50年代，電化學(xué)傳感器主要是將各種信號轉(zhuǎn)化為電信號，通過檢測電流、電阻等的變化來反映檢測物的量。目前檢測致病菌的電化學(xué)傳感器主要有：DNA傳感器、適配體傳感器、免疫傳感器［11－12］。

2.1.1 DNA電化學(xué)傳感器DNA電化學(xué)傳感器是將單鏈DNA作為敏感元件固定在電極表面，加入可指示雜交信息的電活性物質(zhì)，通過檢測修飾電極在待測溶液中電化學(xué)信號的變化，以確定靶DNA的濃度。主要過程：ssDNA的固定、雜交、雜交指示劑、電化學(xué)檢測［13］。

圖1 DNA電化學(xué)傳感器示意圖Fig.1 Schematic diagram of electrochemical DNA biosensor

Elaine Spain［14］等利用DNA傳感器成功的建立了檢測金黃色葡萄球菌的方法。成功的檢測了能引起奶牛發(fā)生乳房炎的金黃色葡萄球菌的的基因。Xue－Mei Li［15］等建立的金納米離子修飾的電極可檢測2個DNA，2個DNA的檢出限濃度都超過10～11μg／m L。Deng Zhang［16］等建立的傳感器能檢測2種來自不同細(xì)菌的DNA，磁性納米粒子修飾致病菌巰基探針能夠識別目標(biāo)DNA的一端，用金納米粒子修飾致病菌巰基探針能識別目標(biāo)DNA另一端，并將金納米粒子探針與NTs（硫化鉛、硫化鎘）結(jié)合，NTs的羧基與納米探針的氨基結(jié)合，通過磁場吸附，NTs游離，通過SWASV進(jìn)行檢測。

DNA傳感器隨著ssDNA的不同，指示劑的不同就可檢測多種致病菌。DNA電化學(xué)傳感器具有快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)［17］，但電化學(xué)DNA傳感器還存在一定的局限，比如如何在電極表面固定多個不同探針，構(gòu)建復(fù)雜基質(zhì)環(huán)境使能夠同時檢測多個DNA，DNA的空間結(jié)構(gòu)的變化，堿基錯配，同源致病菌DNA的相似性對檢測準(zhǔn)確性的影響［18］。

2.1.2 適配體電化學(xué)傳感器電化學(xué)適配體傳感器是由固定了適配體的電極和電化學(xué)活性識別元素構(gòu)成。首先在適當(dāng)條件下將適配體固定到電極表面，將待測目標(biāo)物加入與適配體作用，從而導(dǎo)致電極表面結(jié)構(gòu)的變化；然后通過檢測電化學(xué)信號的變化來檢測目標(biāo)物［19］。

圖2 適配體電化學(xué)傳感器示意圖Fig.2 Schematic diagram of electrochemical aptamers biosensor

Gustavo［20］組成員設(shè)計(jì)的適配體傳感器，適配體和靶分子的結(jié)合使電勢發(fā)生變化，能有效地準(zhǔn)確檢測檢測大腸桿菌O157：H7，檢測下限26 cfu／m L，檢測時間短。曹曉曉［21］等利用獲得的一組能夠與金黃色葡萄球菌特異性結(jié)合的適配體，通過流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)，組合適配體相對于單一的適配體能夠更好地區(qū)分金黃色葡萄球菌細(xì)菌和消減靶細(xì)菌及大腸。在電極表面固定一組適配體，可能會提高檢測的特異性。在電極表面固定不同的適配體，檢測不同的致病菌，是一個可行實(shí)驗(yàn)方案［22］。

細(xì)菌細(xì)胞可以篩選到適配體，細(xì)菌的代謝物如毒素，也可篩選到特異性適配體。作為一類分子識別元件，適配體對其靶標(biāo)具有嚴(yán)格的識別力和高度的結(jié)合力。因此適配體電化學(xué)傳感器具有特異性和選擇性，可實(shí)現(xiàn)對多種細(xì)菌的定性定量檢測。電化學(xué)適配體生物傳感器有一定的局限性，如篩選過程復(fù)雜，易于被剪切降解空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有待提高等，一般可對篩選出來的核酸適配體進(jìn)行修飾。篩選的核酸適配體對靶標(biāo)物的特異性還沒有達(dá)到100%，一個細(xì)胞由于表面的不均一性，可能具有多個適配體，對于檢測的特異性和準(zhǔn)確性都會造成很大的干擾［23－24］。

2.1.3 免疫學(xué)傳感器檢測技術(shù)電化學(xué)免疫傳感器是生物技術(shù)和電化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，免疫學(xué)檢測技術(shù)利用了抗體與抗原的特異性結(jié)合的原理。1990年 Henr［25－26］等提出了免疫傳感器的概念：將高靈敏的傳感技術(shù)與特異性免疫反應(yīng)結(jié)合起來，用以監(jiān)測抗原一抗體反應(yīng)的生物傳感器稱作免疫傳感器。有三個主要元件：感受器、轉(zhuǎn)換器和檢測器。

圖3 電化學(xué)免疫傳感器示意圖Fig.3 Schematic diagram of electrochemical immunosensor

周煥英，高志賢［27］制成的酶免疫傳感器，針對葡萄球菌腸毒素C檢測靈敏度可達(dá)到10μg／L，20 min即可完成。Tahir［28］等采用電化學(xué)免疫傳感器技術(shù)檢測大腸桿菌0157∶H7，可以在10min內(nèi)完成分析，檢測精度可達(dá)10 cfu／m L。Faridah［29］等以辣根過氧化酶為標(biāo)記酶，使用電化學(xué)免疫傳感器檢測鼠傷寒沙門氏菌，檢出下限為20 cfu／m L，表明該方法具有較高的靈敏性。

在表面固定不同的抗體，就可檢測不同的抗原。但有的細(xì)菌會分泌共同抗原，特別是同源的致病菌如腸道菌群，這種方法只能檢測區(qū)分能分泌不同抗原的致病菌。來源于不同致病菌的抗體他們的活性的保持，在小小的表面需要注意抗體之間的相互影響，檢測溶液環(huán)境的確定都會造成結(jié)果的差異很大。免疫學(xué)電化學(xué)傳感器檢測方法具有制樣簡單，測試時間短，成本低，靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用電化學(xué)免疫傳感器對致病菌產(chǎn)生的抗原進(jìn)行測定，需要解決的主要問題是：抗體的標(biāo)記、抗體的活性保持、假陽性的排出、信號測定有一定難度等［30］。

2.2 表面增強(qiáng)拉曼檢測技術(shù)

當(dāng)單色光照射至物質(zhì)上，物質(zhì)分子發(fā)生散射現(xiàn)象，出現(xiàn)與入射光頻率不同的散射光，所形成的光譜稱拉曼光譜。拉曼光譜較微弱，表面增強(qiáng)拉曼（SERS）就應(yīng)運(yùn)而生［31］。表面增強(qiáng)拉曼光譜要與其他技術(shù)結(jié)合，如與DNA、適配體技術(shù)的結(jié)合，才能更準(zhǔn)確的檢測致病菌。SERS是將敏感元件固定在某表面，與修飾了量子點(diǎn)的靶標(biāo)物結(jié)合，利用拉曼光譜照射產(chǎn)生的不同的光譜信號，以確定靶標(biāo)物的量和種類。主要過程：敏感元件的固定、特異性和選擇性結(jié)合、拉曼光譜檢測［32］。

圖4 SERS檢測示意圖Fig.4 Schematic diagram of surface plasmon resonance biosensor

Nam Hoon Kim［33］等介紹了一種方法，適配體與SERS結(jié)合來檢測，檢測后可除去靶標(biāo)物，可以反復(fù)使用。Do Kyun Kim［34］等建立的方法，DNA和拉曼光譜的結(jié)合，可檢測多個DNA序列，檢測下限達(dá)10 fmol／L（50 zmol）。Taejoon Kang［35］等把金粒子固定在金屬絲上，與DNA結(jié)合，在進(jìn)行SERS分析，可檢測多個致病菌，并能在電鏡下觀察到。

目前SERS檢測細(xì)菌細(xì)胞的研究很少，主要原因是細(xì)胞的表面不均一性，表面積較大，所得的譜圖太復(fù)雜，沒有特異性。表面增強(qiáng)拉曼光譜具有方便快捷、檢測靈敏度高、多組分同時檢測等特點(diǎn)，這使得其在檢測樣品中致病菌含量較傳統(tǒng)方法有明顯的優(yōu)勢，但是拉曼光譜的發(fā)生本身對待測物就有一定的要求，不是每種物質(zhì)都適用［36］。

2.3 多重PCR檢測技術(shù)

多重PCR檢測技術(shù)的基本原理就是在體外適宜條件下，以提取得到的DNA為模板，以人工設(shè)計(jì)與合成的寡核苷酸為引物，特異性地擴(kuò)增DNA片段。最后通過電泳技術(shù)與陽性對照進(jìn)行比對，來判斷陰陽性結(jié)果［37］。PCR由加熱變性——退火加引物－升溫延伸，三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成［38］：

圖5 多重PCR技術(shù)檢測示意圖Fig.5 Schematic diagram of detection of multiplex PCR

余以剛，何秋彤［39］等以兩種食源性致病菌（沙門氏菌、單增李斯特菌）為模板，通過對多重?zé)晒釶CR緩沖液的成分、擴(kuò)增所用酶、添加劑等進(jìn)行研究，建立適用細(xì)菌DNA檢測的多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系。Sharma［40］等建立了能在3～4 h內(nèi)檢測出毒素基因多重PCR體系。

多重PCR技術(shù)在實(shí)際的檢驗(yàn)工作還存在一些問題：提取得到的DNA的裂解得到的不完整DNA片段，多重PCR技術(shù)中多組引物之間相互干擾、高濃度模板對低濃度模板產(chǎn)生競爭性抑制等問題［41－42］。相對于傳統(tǒng)檢測方法，多重PCR檢測技術(shù)極大地縮短了檢測時間，提高了檢測靈敏度，且操作簡單、快速，特異度和敏感度較高，是快速檢測和鑒定常見致病菌的一種有效的手段［43］。

3 展望

DNA傳感器、多重PCR技術(shù)是以DNA為檢測目標(biāo)的方法，他們的檢測限低、靈敏度高、時間短、花費(fèi)少、勞動量少，是發(fā)展前景非常好的檢測方法。但是DNA的錯配，特異性檢測受到環(huán)境的干擾，同種屬細(xì)菌的基因序列的同源性，容易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。適配體傳感器與免疫傳感器相比，各有所長。適配體的廉價易得，易保存的優(yōu)點(diǎn)，在檢測致病菌上，有明顯的優(yōu)勢。致病菌可以有共同抗體，但是基本沒有共同的適配體。致病菌細(xì)胞可能有一組適配體。這兩原因?qū)z測的特異性和準(zhǔn)確性造成很大影響?？贵w和抗原結(jié)合的假陽性的出現(xiàn)。表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測技術(shù)重復(fù)性強(qiáng)，敏感度高，不同結(jié)構(gòu)的分子產(chǎn)生的拉曼光譜強(qiáng)弱差異很大，甚至有的分子不產(chǎn)生拉曼光譜現(xiàn)象，降低了表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測方法的適用范圍。

目前多種致病菌同步檢測的方法還僅限于實(shí)驗(yàn)室，繁雜前處理過程以及數(shù)據(jù)處理的復(fù)雜性是他們的缺點(diǎn)。研究宜攜帶的試紙條，在生產(chǎn)過程能檢測，提高檢測的時效性和方便性，不損壞產(chǎn)品的，降低食品損壞成本，檢測結(jié)果為不同顏色及顏色深淺，檢測過程的簡單化，是未來一段時間的研究發(fā)展方向［44］。

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Research Advance Study of the Synchronous Detection of Multiplex Foodborne Pathogens

SUN Xiu－lan1，2，ZHANG Fang1，2，ZHANG Yin－zhi1

（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiang Nan University，Wu Xi 214063，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214036，China）

In this review，the detection targets such as bacteria colonies，bacteria cell i，DNA and bacteria metabolic products are firstly introduced.Then the detection methods which can synchronously indentify Multiplex Food－borne Pathogens electrochemical DNA biosensor，Aptamer biosensor，Electrochemical immunosensor，Surface plasmon resonance biosensor and Multiplex PCR were summarized.Based on the above progress，the the challenge and perspective of detection method were put forward.

detection targets，multiplex foodborne pathogens，synchronous detection

TS 201

A

1673－1689（2012）05－0449－06

2011－03－22

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20806033），2010年度公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)項(xiàng)目（201003008－08）。

孫秀蘭（1976－），女，山東聊城人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事食品安全檢測方面研究。E－mail：sxlzzz＠yahoo.com.cn