Pokemon和P14ARF蛋白在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及臨床意義

陳 軍 覃思繁 林思彤 韋常宏

Pokemon基因即POK紅系髓性致癌因子(POK erythroid myeloid ontogenic factor)是2005年被確定的1種原癌基因[1]，其蛋白產(chǎn)物不僅可以使癌細(xì)胞獲得抗老化和抗死亡的能力，還能調(diào)控其他癌基因或抑癌基因的活性。Pokemon過表達(dá)導(dǎo)致ARF降低，通過MDM2使p53突變增加，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，因此Pokemon被認(rèn)為是腫瘤的總開關(guān)[2]。本研究檢查原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma HCC)組織及相應(yīng)癌旁組織中Pokemon和P14ARF蛋白的表達(dá)情況，以了解它們在人原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

60例肝癌組織，取自廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2008年8月～2009年8月肝癌患者手術(shù)切除的標(biāo)本，經(jīng)術(shù)后病理診斷為肝細(xì)胞癌。60例中男性42例，女性18例，年齡22～65歲，平均年齡(42.3±12.1)歲，中位年齡46歲。所有患者術(shù)前均未行任何治療。按UICC 2002年TNM分期，根據(jù)按Edmondeon 病理分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分級。每例均取癌及對應(yīng)癌旁肝組織(距腫瘤邊緣2 cm)。

1.2 方法

免疫組織化學(xué)檢查采用Envision兩步法。Pokemon濃縮型兔抗人多克隆抗體購自英國Abcam公司，抗體稀釋濃度為1∶100。P14ARF兔抗人多克隆抗體購自福州邁新生物技術(shù)科技公司，抗體稀釋濃度為1∶100。即用型快捷MaxvisionTM檢測試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)科技公司。整個過程按試劑盒說明書進(jìn)行。每批染色均設(shè)已知陽性切片作陽性對照，用磷酸鹽緩沖液(phosphatic buffered saline，PBS)代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷

Pokemon及P14ARF表達(dá)產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。由2位醫(yī)師采用雙盲法觀察每張切片。陽性判斷根據(jù)染色程度和免疫陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞總數(shù)百分比綜合記分。按切片中癌細(xì)胞染色強(qiáng)度計分：0分細(xì)胞無顯色；1分呈淡黃色；2分呈棕黃色；3分呈棕褐色(染色深淺需與背景著色相對比)；再按切片中陽性癌細(xì)胞數(shù)所占的百分比打分：0分為陰性，1分為陽性癌細(xì)胞占比≤10%；2分為11%～50%，3分為50%～75%，4分為75%以上。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積>3分才算免疫反應(yīng)陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS11.0軟件進(jìn)行χ2檢驗，Spearman相關(guān)性分析，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織及癌旁組織中Pokemon和P14ARF蛋白的表達(dá)

肝癌組織及癌旁組織中Pokemon表達(dá)陽性率分別為65.0%(39/60)和31.7%(19/60)，2組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.348，P=0.000)；P14ARF表達(dá)陽性率分別為63.3%(38/60)和91.7%(55/60)，2組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.811，P=0.000)。

2.2 Pokemon和P14ARF蛋白表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系

通過比較Pokemon和P14ARF蛋白表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Pokemon蛋白表達(dá)陽性與臨床分期、腫瘤直徑、腫瘤分化程度有關(guān)(P<0.05)，與脈管癌栓、術(shù)后復(fù)發(fā)、肝外轉(zhuǎn)移、腫瘤個數(shù)及血清AFP等無關(guān)(P>0.05)；P14ARF蛋白表達(dá)在腫瘤分化程度組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與臨床分期、脈管癌栓、術(shù)后復(fù)發(fā)、肝外轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑、腫瘤個數(shù)及血清AFP等無關(guān)(P>0.05)(表1)。

表1 肝癌組織中Pokemon和P14ARF蛋白表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3 Pokemon和P14ARF蛋白在肝癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

21例Pokemon表達(dá)陰性的標(biāo)本中有17例P14ARF蛋白表達(dá)陽性(81.0%)，38例P14ARF表達(dá)陽性的標(biāo)本中17例Pokemon表達(dá)陰性(44.7%)，經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，Pokemon和P14ARF蛋白表達(dá)在肝癌組織中表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(γ=-0.268，P=0.038)(表2)。

表2 肝癌組織中Pokemon和P14ARF蛋白表達(dá)的關(guān)系(例)

3 討論

Pokemon基因即POK紅系髓性致癌因子(POK erythroid myeloid ontogenic factor)，定位于19p13.3，具有2個外顯子和2個內(nèi)含子，屬于POK家族。POK蛋白在胚胎發(fā)育、分化和腫瘤形成中有重要作用[3]。近年來越來越多的臨床研究顯示了Pokemon在腫瘤發(fā)生中的作用。Apostolopoulou等[4]在研究非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)pokemon高表達(dá)，推測其可能在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生過程中具有重要作用。付朝江等[5]在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)Pokemon mRNA在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁乳腺組織及乳腺增生組織，其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級相關(guān)。我們的研究亦得到類似的結(jié)果，Pokemon在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，且與臨床分期、腫瘤直徑、腫瘤分化程度密切相關(guān)，提示其在肝細(xì)胞癌的發(fā)生與進(jìn)展中可能起著重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)控的G1途徑異常起了重要作用。G1途徑包括：由P16INK4A-CyclinD1-CD4/6-pRb-E2F組成的Rb通路(P16-Rb)和P14ARF-MDM2-p53組成的p53通路(P14ARF-p53)，各因子互相影響，形成復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制[6]。P14ARF-p53通路是細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要一環(huán)，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后起著重要作用[7]。研究已發(fā)現(xiàn)P14ARF在膠質(zhì)瘤、乳腺癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤中表達(dá)均下調(diào)。本研究表明60例人肝細(xì)胞癌腫瘤標(biāo)本中22例P14ARF缺失，而在癌旁組織中僅缺失5例，顯示了在肝細(xì)胞癌中P14ARF表達(dá)明顯下調(diào)的現(xiàn)象，這與文獻(xiàn)報道的基本一致。進(jìn)一步分析P14ARF蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，高分化肝細(xì)胞癌(Ⅰ～Ⅱ級)患者的P14ARF蛋白的缺失率(19.2%)明顯低于低分化肝細(xì)胞癌(Ⅲ～Ⅳ級)患者的缺失率(50.0%)，這提示P14ARF表達(dá)缺失與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展有一定的相關(guān)性，提示P14ARF基因失活可能是肝細(xì)胞癌惡性演變的重要因素。Pokemon基因作為1種轉(zhuǎn)錄抑制因子可影響多種腫瘤相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄，研究發(fā)現(xiàn)Pokemon強(qiáng)效抑制在細(xì)胞周期阻滯中起重要作用的腫瘤抑制因子Rb基因的轉(zhuǎn)錄[8]。Maeda等[2]運(yùn)用熒光素酶標(biāo)記處理ARF激動劑，觀察標(biāo)記物的活性，發(fā)現(xiàn)Pokemon通過劑量依賴模式有效地抑制了P19ARF和P14ARF,同時確定了這種抑制活性的作用需要POZ/BTB域和鋅指結(jié)構(gòu),證明Pokemon是ARF的特異性抑制劑，推測Pokemon通過P14ARF-MDM2-p53通路發(fā)揮致癌作用。Choi等[9]最新的研究認(rèn)為Pokemon作為ARF-Hdm2(人類中與鼠Mdm2同源蛋白)-p53-p21通路的主要控制因素，通過阻斷或限制ARF到Hdm2的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)p53的表達(dá)最終影響到p21的表達(dá)。故從理論上推測，Pokemon應(yīng)該作為上游關(guān)鍵基因?qū)14ARF有負(fù)調(diào)節(jié)作用。我們的研究分析顯示兩者間存在弱的負(fù)相關(guān)關(guān)系(γ=-0.268，P=0.038),提示Pokemon和P14ARF之間可能不是僅存在單一的線性關(guān)系，可能有更多的基因參與了彼此的調(diào)節(jié)。

總之，肝癌的發(fā)生及發(fā)展是1個十分復(fù)雜的過程，Pokemon基因高表達(dá)及P14ARF基因的表達(dá)缺失在其中起著十分重要的作用。相信通過進(jìn)一步研究Pokemon和P14ARF基因在肝細(xì)胞癌中的狀態(tài)以及它們之間的聯(lián)系，將為肝細(xì)胞癌的分子機(jī)制和基因治療提供十分有用的幫助。

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