5-氮雜-2′-脫氧胞苷逆轉(zhuǎn)CNE-2Z 細胞RASSF1A基因甲基化的研究

姚運紅 鄧 巖 胡新榮 高洪彬 唐澤立

鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展涉及眾多基因的甲基化[1]。Ras相關結(jié)構(gòu)域家族1A(RASSF1A)基因是新近發(fā)現(xiàn)的潛在腫瘤抑制基因[2,3]。在多種腫瘤組織中RASSF1A基因由于基因的突變、缺失或由于啟動子區(qū)高甲基化而引起低表達或不表達[2～7]。在鼻咽癌中，RASSF1A是常見的甲基化基因之一，但文獻報道的RASSF1A甲基化情況不一致[2～5,8,9]，目前針對鼻咽細胞系CNE-2Z的RASSF1A基因甲基化及去甲基化的研究也不多見。本文應用去甲基化劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)處理人低分化鼻咽癌細胞系CNE-2Z，觀察RASSF1A基因的去甲基化特點及重新表達的情況及CAN-2Z細胞的生長和克隆形成能力的改變，旨在探討該基因在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

CNE-2Z(人低分化鼻咽癌細胞系)，廣東醫(yī)學院病理教研室建株并保存。PCR擴增儀(9600型，PE公司，USA)，EZ-DNA甲基化試劑盒Gold(D5005，Zymo公司)，5-Aza-CdR(5 mg/支，A3656，sigma公司)，DNA提取試劑盒(北京中杉公司)，PCR Master-mix (KT205-01,Invitrogen公司)，免疫細胞化學試劑[鼠抗人RASSF1A單克隆抗體(50 μl,ARF0551,ATGEN公司)、SP-9000通用型試劑盒、PBS緩沖液(2000 ml/包)、抗體稀釋液(ZLI-9028)、DAB顯色試劑盒等均購自北京中杉公司]。RASSF1A基因甲基化特異引物對(M)和非甲基化引物對(U)，含兩組4對，均由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。一組序列[6],M1(93 bp):5′-GTGTTAACGCGTTGCGTATC-3′和5′-AACCCCGCGAACTAAAAACGA-3′,U1(105 bp)：5′-TTTGGTTGGAGTGTGTTAATGTG-3′和5′-CAAACCCCACAA-ACTAAAAACAA-3′；二組序列[7]M2(169 bp)：5′-GCTAACAAACGCGAACCG-3′和5′-GGGTTTTGCGA-GAGCGCG-3′，U2(169 bp)：5′-CACTAACAAACACAAACC-3′和5′-GGTTTTTGTGAGAGTGTGTTTAG-3′。

1.2 實驗方法

1.2.1 CNE-2Z 細胞培養(yǎng) CNE-2Z細胞系于RPMI-1640培養(yǎng)液中(含10%新生小牛血清，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml，0.056%NaHCO3，調(diào)節(jié)pH值至7.4)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，0.25%胰酶-EDTA消化傳代。

1.2.2 5-Aza-CdR處理實驗 5-Aza-CdR 5 mg，溶解于1 ml PBS緩沖液中，再調(diào)配成1×10-5M(高濃度)和5×10-6M(低濃度)溶液，低溫-60℃～-80℃保存。常規(guī)消化細胞傳代，培養(yǎng)24 h后加入5-Aza-CdR處理，24 h后更換含5-Aza-CdR的新鮮生長液，培養(yǎng)3天后換成不含5-Aza-CdR的生長液繼續(xù)培養(yǎng)。對照組用PBS代替5-Aza-CdR。

1.2.3 甲基化特異性PCR DNA抽提及亞硫酸氫鹽修飾：收集5-Aza-CdR處理CNE-2Z細胞和對照組CNE-2Z細胞，應用DNA提取試劑盒和EZ-DNA甲基化試劑盒Gold，并按相應的說明書進行DNA提取和DNA亞硫酸氫鹽修飾試及純化。

甲基化特異性PCR：反應體系25 μL，包括2×Master-mix 12.5 μL、亞硫酸氫鹽修飾DNA 2.5 μL、10 μM正反方向引物各2.5 μL、水5.0 μL。 一組引物反應程序[5]：95 ℃預變性12 min,95 ℃、55 ℃、72 ℃各1 min,40個循環(huán)，然后72 ℃延伸5 min；二組引物反應程序[6]：95 ℃預變性15 min,94 ℃ 30 s、58 ℃ 40 s、72 ℃ 30 s，40個循環(huán)，然后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，應用紫外成像儀照相分析。

1.2.4 免疫細胞化學 采用SP法進行染色，步驟如下：將CNE-2Z細胞接種在處理好的蓋玻片上，置于6孔板中，培養(yǎng)24 h后加入5-Aza-CdR處理，在實驗各時間點終止培養(yǎng)取出細胞爬片，用冷PBS洗5 min×3次，預冷甲醇-丙酮固定液固定10 min。對照組不用5-Aza-CdR處理。在細胞爬片上滴加3%甲醇-過氧化氫，室溫孵育10 min，以阻斷過氧化物酶。冷PBS洗5 min×3次，滴加正常山羊血清，室溫孵育10 min，甩去多余血清。滴加鼠抗人單克隆抗體RASSF1A(1∶100比例稀釋)，以PBS代替一抗作為空白對照，4℃冰箱孵育過夜。冷PBS洗5 min×3次，滴加生物素標記的二抗，室溫孵育15～25 min，冷PBS洗5 min×3次。滴加鏈霉素親生物素蛋白-過氧化物酶溶液(三抗)，室溫孵育15～25 min，冷PBS洗5 min×3次。DAB顯色，蘇木精輕度復染，脫水，透明，晾干后樹脂封片。顯微鏡下觀察，以胞質(zhì)著色為陽性。

1.2.5 細胞生長曲線 把細胞置于6孔板中培養(yǎng)(1×105/孔)，每天收集6孔細胞分別計數(shù)，取其平均數(shù)，連續(xù)計數(shù)6天后描繪細胞生長曲線。

1.2.6 平板克隆形成率 實驗組細胞用5-Aza-CdR處理4天，換新鮮生長液培養(yǎng)2天；對照組細胞不用5-Aza-CdR處理。把培養(yǎng)細胞制成800個/ml的細胞懸液，按1 ml/孔加入6孔培養(yǎng)板中，另加1 ml培養(yǎng)液，置37℃、5%培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10天，每組共6孔。10天后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌，甲醇固定10 min，姬姆薩染色10～20 min。在顯微鏡下計數(shù)直徑大于50 μm(或者含50個細胞以上)的細胞克隆數(shù)，計算克隆形成率(%)=每孔克隆形成數(shù)/每孔接種細胞總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用卡方檢驗分析平板克隆形成率。

2 結(jié)果

2.1 CNE-2Z細胞株RASSF1A基因高度甲基化

PCR擴增檢測結(jié)果見圖1，兩組引物都擴增出甲基化特異性產(chǎn)物，分別是M1(93 bp)和M2(169 bp),但都未擴增出非甲基化產(chǎn)物(U1和U2泳道)。說明CNE-2Z細胞株RASSF1A基因呈高度甲基化。

2.2 經(jīng)5-Aza-CdR處理的CNE-2Z細胞RASSF1A基因去甲基化情況

選擇第一組PCR引物，對經(jīng)5-Aza-CdR處理CNE-2Z細胞RASSF1A基因進行PCR擴增檢測。CNE-2Z細胞分別用0 M(作為對照)、5×10-6M和1×10-5M 5-Aza-CdR處理1～4天，第4天后停藥1～2天。以每天為一個時間點收集細胞提取DNA，經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后進行PCR擴增檢測。

圖1 未經(jīng)5-Aza-CdR處理CNE-2Z細胞RASSF1A基因MSP電泳結(jié)果

M1和M2分別為第一、第二組甲基化特異PCR(MSP)產(chǎn)物；U1和U2分別為第一、第二組非甲基化PCR產(chǎn)物

由圖2可見，2種濃度5-Aza-CdR處理第1和第2天的CNE細胞，與對照組細胞一樣，僅被擴增出甲基化產(chǎn)物，說明RASSF1A基因仍處于甲基化狀態(tài)；處理第3天，2種濃度5-Aza-CdR處理的CNE細胞都被擴增出甲基化產(chǎn)物和非甲基化產(chǎn)物，說明RASSF1A基因部分去甲基化；處理第4天，2種濃度5-Aza-CdR處理的CNE細胞僅被擴增出非甲基化產(chǎn)物，說明RASSF1A基因完全去甲基化；用藥4天后停藥1～2天，5-Aza-CdR處理過的CNE細胞仍僅被擴增出非甲基化產(chǎn)物，說明RASSF1A基因完全去甲基化至少可以保持2天以上。

圖2 經(jīng)5-Aza-CdR處理CNE-2Z細胞RASSF1A基因的MSP電泳結(jié)果

2.3 經(jīng)5-Aza-CdR處理的CNE-2Z細胞對RASSF1A的作用

未經(jīng)5-Aza-CdR處理和經(jīng)5-Aza-CdR處理1～2天后的CNE-2Z細胞，經(jīng)免疫細胞化學檢測到RASSF1A表達。經(jīng)5-Aza-CdR處理的CNE-2Z細胞，第3天RASSF1A呈弱表達，第4天呈較強表達，第4天后停藥1～2天，仍檢測到呈明顯表達，與RASSF1A基因去甲基化狀態(tài)吻合。

2.4 經(jīng)5-Aza-CdR處理的CNE-2Z細胞生長情況

圖3 5-Aza-CdR處理4天后CNE-2Z細胞生長曲線

5-Aza-CdR處理4天后更換不含5-Aza-CdR的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞6天描繪細胞生長曲線。對照組為未加5-Aza-CdR的CNE-2Z細胞。由圖3可見，用藥第1天兩組細胞增殖速度就明顯較對照組慢，對照組第2天出現(xiàn)倍增，用藥兩組倍增出現(xiàn)在第2～3天，低濃度組和高濃度組第1～2天差異不明顯，第3天出現(xiàn)差異，高濃度組增殖速度較低濃度組緩慢，但不明顯。

圖4 5-Aza-CdR處理4天后停藥2天CNE-2Z細胞生長曲線

5-Aza-CdR處理4天后停藥2天，更換不含5-Aza-CdR的培養(yǎng)液培養(yǎng)6天描繪細胞生長曲線。對照組為未加5-Aza-CdR的CNE-2Z細胞。由圖4可見，第1天3組增殖情況無顯著差異，第2天用藥兩組增殖速度較對照組稍慢，第3天后用藥組增殖速度明顯較對照組緩慢，用藥兩組間差異不明顯。

2.5 經(jīng)5-Aza-CdR處理的CNE-2Z細胞平板克隆形成率

對照組CNE-2Z細胞培養(yǎng)7天即可見克隆形成，而1×10-5M 5-Aza-CdR處理組細胞此時未見克隆形成。實驗組和對照組克隆形成率分別為5.4%和10.8%(χ2=14.62,P<0.05)，表明5-Aza-CdR處理CNE-2Z細胞的克隆形成率較對照組顯著降低。

3 討論

CNE-2細胞是人低分化鼻咽癌細胞系和研究鼻咽癌多方面生物學特性的很有用的細胞模型。有研究者用砒霜處理CNE-2細胞可以誘導Rassf1a基因去甲基化和表達升高[10]，提示CNE-2細胞的Rassf1a 基因處于甲基化狀態(tài)。還有研究者直接用去甲基化劑5-Aza-CdR處理CNE-2細胞，用MSP檢測到非處理細胞和低濃度5-Aza-CdR處理細胞的Rassf1a基因的甲基化特異性和非特異性PCR擴增產(chǎn)物，提示CNE-2細胞的Rassf1a 基因處于半甲基化狀態(tài)[8,11]。本組用MSP僅檢測到CEN-2Z細胞的Rassf1a基因的甲基化特異性產(chǎn)物，表明Rassf1a基因呈完全甲基化狀態(tài)，與文獻[8,11]報道的不完全一致。產(chǎn)生半甲基化的原因是該基因在部分細胞中完全甲基化而在另一部分細胞中非甲基化，或在同一個細胞中的一個等位基因甲基化而另一個等位基因非甲基化，使甲基化特異性引物和非特異性引物都得以擴增出PCR產(chǎn)物。此外，在實驗過程中對樣本DNA的亞硫酸氫鹽修飾不徹底，未能將全部的甲基化的C轉(zhuǎn)變?yōu)閁→T時，也可擴增出甲基化特異性和非特異性PCR產(chǎn)物。至于CNE-2Z細胞的Rassf1a基因是完全甲基化還是半甲基化有待更多的研究證實。

本實驗結(jié)果表明，CNE-2Z細胞經(jīng)5-Aza-CdR處理后，第1～2天RASSF1A基因仍呈完全甲基化狀態(tài)，第3天部分去甲基化，第4天后全部去甲基化，停止5-Aza-CdR處理后2天仍保持完全去甲基化狀態(tài)。本實驗比以往文獻[8,11]更詳細描述了經(jīng)5-Aza-CdR處理后的CNE-2Z細胞RASSF1A基因的去甲基化規(guī)律，對進一步研究RASSF1A基因影響鼻咽癌細胞的生物學行為及其機制提供了實用基礎。本實驗結(jié)果同時也說明在鼻咽癌中RASSF1A基因被5-Aza-CdR誘導去甲基化后停藥其去甲基化狀態(tài)可持續(xù)至少2天以上的時間并發(fā)揮抑癌作用，為研究針對RASSF1A基因甲基化的治療鼻咽癌的新方法提供了線索。

本實驗結(jié)果表明，CNE-2Z細胞經(jīng)5-Aza-CdR處理后，RASSF1A基因蛋白表達水平顯著升高，細胞生長和克隆形成能力顯著抑制。提示RASSF1A基因可能是鼻咽癌的抑癌基因，其在鼻咽癌中失活的機制可能是高度甲基化。但是，由于5-Aza-CdR是非選擇性的去甲基化劑，可能同時使許多鼻咽癌的抑癌基因包括Rassf1a、14-3-3σ、DAPK等基因去甲基化[8,10～13]。因此，5-Aza-CdR處理導致CNE-2Z細胞的生物學行為改變，是眾多抑癌基因去甲基化的綜合結(jié)果，還不足以說明是Rassf1a的直接作用，而要說明Rassf1a基因?qū)Ρ茄拾┚哂兄苯右种谱饔?，需要設計其他實驗，這將是本研究小組的下一步的研究工作。

張文靜等[14]用5-Aza-CdR處理鼻咽癌細胞系5-8F細胞后觀察蛋白質(zhì)組學的改變，鑒定了33個表達差異的基因，其中15個基因的蛋白表達水平上調(diào)。在上調(diào)的基因中并不包含Rassf1a基因。也許不同的細胞，盡管都是鼻咽癌細胞，其基因背景不同，可導致基因的甲基化譜的不同，這是在研究時值得注意的問題。

[1]陳應超，蘭 花，張少容.DNA 甲基化與鼻咽癌〔J〕.江西醫(yī)藥，2007，42(1)：79.

[2]Zhou L,Jiang W,Ren C,et al.Frequent hypermethylation of RASSF1A and TSLC1,and high viral load of Epstein-Barr Virus DNA in nasopharyngeal carcinoma and matched tumor-adjacent tissues 〔J〕.Neoplasia,2005,7(9)：809.

[3]Lo KW,Kwong J,Hui AB,et al.High frequency of promoter hypermethylation of RASSF1A in nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Cancer Res,2001,61(10)：3877.

[4]Pan ZG,Kashuba VI,Liu XQ,et al.High frequency somatic mutations in RASSF1A in nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Cancer Biol Ther,2005,4(10)：1116.

[5]Burbee DG,Forgacs E,Zochbauer Muller S,et al.Epigenetic inactivation of RASSF1A in lung and breast cancer and malignant phenotype suppression〔J〕.J Natl Cancer Inst,2001,93(9):691.

[6]徐美榮,許建成,陳 云,等.RASSF1A、CK19和p53在甲狀腺良惡性病變中的表達及臨床意義〔J〕.實用癌癥雜志,2010,25(6):583.

[7]張家浩，姜昊文，顧靜文，等.RASSF1A 基因在前列腺癌中甲基化檢測及其表達〔J〕.上海醫(yī)學雜志,2005,28(5):366.

[8]劉 偉,陳葉珊,姚 杰,等.鼻咽鱗癌組織RASSF1A 基因表達失活及其臨床意義的探討〔J〕.中華腫瘤防治雜志 ，2009，16(6)：424.

[9]鄧 巖，姚運紅，胡新榮,等.鼻咽癌組織中RASSF1A基因甲基化的研究〔J〕.世界腫瘤雜志，2009，8(1)：44.

[10]Hu JL,Zhang YF,Qiu ZD,et al.Induced RAS association domain family gene 1A gene expression by arsenic trioxide in nasopharyngeal carcinoma cell〔J〕.Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi，2009，44(10):866.

[11]Wang T,Liu H,Chen Y,et al.Methylation associated inactivation of RASSF1A and its synergistic effect with activated K-Ras in nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Journal of Experimental & Clinical Cancer Research Research，2009,28:160.

[12]張 松,孔維佳,郭長凱,等.5-雜氮-2′-脫氧胞苷抑制人鼻咽癌CNE細胞生長的機制〔J〕.華中科技大學學報(醫(yī)學版),2006，35(6):795.

[13]張 松,孔維佳,王彥君,等.5-雜氮-2′-脫氧胞苷對人鼻咽癌裸鼠移植瘤的抑制作用〔J〕.癌癥，2005,24(10):1201.

[14]張文靜,易 紅,李茂玉,等.5-Aza-CdR處理鼻咽癌細胞前后的差異蛋白質(zhì)組學研究〔J〕.國際病理科學與臨床雜志，2007,27(4):277.