染色質免疫沉淀分析胰島β細胞中TCF7L2與GPR40的結合*

畢健琨，任 偉,鄭曉雅,許 丹

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內分泌科 400016)

2型糖尿病(T2DM)屬于復雜的多基因疾病，遺傳因素與環(huán)境因素共同參與發(fā)病過程。2006年首次報道TCF7L2，即T細胞轉錄因子-4(TCF-4)單核苷酸多態(tài)性與T2DM顯著相關[1]，Weedon等[2]認為TCF7L2 rs7903146位點基因變異型是目前發(fā)現的和T2DM發(fā)病風險相關性最強的基因型。隨后在多范圍大樣本的研究中得到類似的結果。TCF7L2位于染色體10q25.3，表達產物是高遷移率(HMG)組盒包含的1個轉錄因子。TCF7L2是T細胞因子/淋巴細胞增強子結合因子(TCF/LEF)之一。

GPR40是G蛋白偶聯(lián)受體家族(GPCRs)成員之一。它在腦、胰腺、肝、心臟、骨骼肌等均有表達[3-4]，尤其在胰島、腦組織中表達豐富。GPR40是脂肪酸的特異性受體，脂肪酸作為胞外配體，活化GPR40，激活胰島β細胞內信號轉導途徑，調節(jié)胰島素分泌。GPR40在脂肪酸增強GSIS和促進胰島β細胞過度增殖，進而在引起胰島β細胞功能缺陷中扮演重要角色。2007年，Reut等[5]發(fā)現GPR40與轉錄因子PDX-1存在特異性結合位點，但是GPR40是否與轉錄因子TCF7L2存在結合位點，目前尚不清楚。

在后基因組時代，DNA-蛋白質的相互作用是研究基因表達調控的重要領域。染色質免疫沉淀技術(chromatin immunoprecipitation，CHIP)，是一種在體內研究DNA-蛋白質相互作用的理想方法，利用抗原抗體反應的特異性以及PCR的高靈敏性，可以真實地反映體內蛋白因子與基因組結合的狀況，已成為染色質水平基因表達調控研究的最有效方法。本研究擬通過CHIP技術探討GPR40蛋白與TCF7L2基因是否存在相互作用。

1 材料與方法

1．1材料

1．1．1細胞株 胰島βTC6細胞購買于中國科學院細胞庫。

1．1．2主要試劑和儀器 PAA胎牛血清(德國德圖)，DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，TCF7L2的抗體為兔抗人TCF7L2單克隆抗體C9B9(美國Cell signaling technology)，PCR引物由上海生工生物工程技術服務公司合成。CHIP試劑盒為美國Millipore公司magna chipTMA。超聲破碎儀為美國Sonic公司VC750型，PCR儀為美國MJ公司 PTC-200型。

1．2方法

1．2．1胰島βTC6細胞的培養(yǎng)及細胞的甲醛交連 胰島βTC6細胞用含20%的胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液在37 ℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，2 d換液，7 d傳代1次。實驗時取對數生長期細胞。取1培養(yǎng)皿細胞(10 cm培養(yǎng)皿)，吸掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，加入10 mL 1%甲醛，37 ℃孵育10 min。加入1.25 mol/L甘氨酸1 mL，至終濃度為125 mmol/L，室溫下放置2 min。棄上清液，用1 mL冷PBS刮細胞，移至1.5 mL的EP管中，2 500 r/min離心5 min，棄上清，加入800 μL PBS，4 ℃預冷15 min，然后4 ℃ 2 500 r/min離心5 min，重復PBS清洗1遍。然后用包含10 mmol/L HEPES pH7.5，10 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L EGTA，0.75% Triton X-100的溶液清洗細胞一遍，再用包含10 mmol/L HEPES pH7.5，200 mV Nacl，1 mmol/L EDTA,0.5 mmol/L EGTA的溶液清洗細胞一遍。

1．2．2超聲破碎 在樣品中加入1 mL的lysis buffer(150 mmol/L Nacl 1% Triton X-100,25 mmol/L Tris pH7.5,0.1%SDS,0.5%脫氧膽酸鹽),充分混勻，超聲震蕩，30%功率震蕩強度(10 s+60 s)×10次，4 ℃ 2 500 r/min離心5 min，取上清，測蛋白濃度。

1．2．3檢驗超聲破碎效果 取100 μL超聲破碎后產物，加入4 μL 5 mol/L NaCl，65 ℃處理2 h解交聯(lián)。分出一半用氯仿抽提。電泳檢測超聲破碎后的效果。

1．2．4免疫沉淀 取200～500 μg蛋白，加入80 μL蛋白A瓊脂糖/鮭精DNA，室溫下放置30 min。4 ℃ 2 500 r/min離心5 min，留蛋白上清總體積的10% 作為input，然后將剩余上清分成2份，分別加目的TCF7L2抗體、陽性對照乙?；M蛋白H3抗體和陰性對照IgG。4 ℃ 150 r/min放搖床過夜。次日早晨，每樣品加入60 μL蛋白A瓊脂糖/鮭精DNA，4 ℃放置4 h，4 ℃ 2 500 r/min離心5 min，棄上清液。每管加入500 μL RIPA buffer(150 mmol/L Nacl，50 mmol/L Tris-HCl pH8，0.1% SDS，0.5% Deoxycholat，1 mmol/L EDTA，1% NP-40)，4 ℃放置15 min，4 ℃ 2 500 r/min離心5 min，棄上清液。分別用預冷high salt buffer(50 mmol/L Tris-Hcl pH8，0.1% SDS，0.5% Deoxycholate，1 mmol/L EDTA，1% NP-40，500 mmol/L Nacl)和LiCl buffer(50 mmol/L Tris-Hcl pH8，250 mmol/L Licl，0.1% SDS，0.5% Deoxycholate，1% NP-40，1 mmol/L EDTA)洗膠一遍，用預冷TE buffer(10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA)洗膠2遍，棄上清液。

1．2．5蛋白質/DNA復合物的洗脫及DNA的去交聯(lián) 向膠中加入250 μL Elution buffer(1% SDS，0.1 mol/L NaHCO3)，室溫放置15 min，2 500 r/min離心5 min，轉移上清液至新EP管，重復洗一遍。取上清液(500 μL)于新EP管，加20 μL Nacl(5 mol/L)，混勻，input加Elution Buffer補體積至500 μL，再加20 μL Nacl(5 mol/L)(如：100 μL input+4 μL Elution Buffer+20 μL 5 mol/L Nacl)一起65 ℃水浴過夜。取出置室溫，加入2 μL ProteinaseK(10 mg/mL)，45 ℃水浴1 h。加入等體積(520 μL)氯仿，劇烈震蕩10 s，室溫，12 000 r/min離心1 min，將含DNA上層400 μL移入新管中，加1/10體積即40 μL 3 mol/L乙酸鈉，稍加震蕩，加2體積即800 μL 100%預冷乙醇，加1 μL(20 μg) 糖原，震蕩混勻，置-30 ℃過夜，充分沉淀DNA。12 000 r/min離心10 min。加入1 mL 70% 乙醇，混勻，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，室溫干燥至少30 min。加入dH20 50～100 μL， 65 ℃水浴至少30 min。洗脫后的DNA即可進行PCR檢測。

1．2．6PCR及瓊脂糖凝膠電泳檢測 設計GPR40基因引物為5′-CTC ACA GTC CTC CCA GGG TC-3′，5′-CTT CAG TGC GAC ATC GTC TT-3′，預計擴增長度為155 bp。擴增體系為10 μL，PCR Mix 5 μL，超純水3 μL，DNA模板1 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL。擴增條件，94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環(huán)后72 ℃延伸7 min。PCR反應結束后，取4 μL擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察并分析結果。

2 結 果

2．1胰島βTC6細胞株核染色質切割有效性的確定 為了得到合適大小的DNA片段，摸索了不同的超聲功率，超聲時間的超聲破碎條件，最終得到了合適的條件，使得DNA片段長度為100～1 000 bp(圖1)。

2．2TCF7L2抗體免疫沉淀DNA模板的PCR擴增結果檢測 陽性對照乙?；M蛋白H3抗體免疫沉淀的DNA為模板，陰性對照以IgG抗體免疫沉淀的DNA為模板，陽性對照條帶清晰明亮。而陰性對照看不見擴增產物。結果說明實驗中沉淀可信。以TCF7L2抗體免疫沉淀的染色質片斷提取的DNA為模板，PCR擴增GPR40，結果顯示模板中含有被擴增區(qū)段的DNA(圖2)。

1：對照(未超聲破碎);2、3：超聲打斷后的染色質。

1：乙?；M蛋白H3抗體免疫沉淀的DNA;2：TCF7L2抗體免疫沉淀的DNA;3：羊抗人IgG抗體免疫沉淀的DNA;4：DEPC水;M:DNA Marker。

3 討 論

染色質免疫沉淀技術是基于體內分析發(fā)展起來的方法，已經成為表觀遺傳信息研究的主要方法。它能夠較真實地反映體內狀態(tài)下染色質與基因轉錄調控因子的結合情況[6]。這種方法與DNA芯片與分子克隆技術相結合，可用于高通量的篩選已知蛋白因子的未知DNA靶點和研究反式作用因子在整個基因組上的分布情況，這將有助于深入了解DNA-蛋白質相互作用的調控網絡[7]。

染色質免疫沉淀技術雖然在基因表達調控中發(fā)揮了越來越重要的作用，但是該技術操作繁瑣、復雜，實驗操作對實驗結果影響較大，其中DNA片段的大小對實驗結果起著較大的影響[8]。DNA片段較大，不利于區(qū)分染色質上結合有目的蛋白和沒有結合目的蛋白的區(qū)域，DNA片段較小不利于PCR擴增。因此，適當的DNA片段大小對于染色質免疫沉淀的結果非常重要，一般認為100～1 000 bp的長度范圍是比較合適的。此外，用于染色質免疫沉淀的抗體的質量直接決定實驗的成敗，一般用于免疫組化和Westeren blotting的抗體不適合用于做染色質免疫沉淀，染色質免疫沉淀需要更高特異性的抗體?？贵w的用量也特別重要，抗體用量過多可能會沉淀某些非特異性蛋白，抗體用量過少則特異蛋白沉淀不完全，適宜的抗體量是剛好沉淀經超聲剪切的特異性蛋白[9]。只有優(yōu)化各種實驗條件，才能得到較滿意的染色質免疫沉淀的實驗結果。

胰島β細胞通過分泌適量的胰島素來維持機體的需要，這對保持機體的代謝平衡起到了決定性的作用。胰島素的分泌主要取決于血糖的波動，同時，營養(yǎng)因素，神經傳導作用以及激素的相互作用均對胰島素的分泌產生影響[10]。為了實現其重要的生理作用，胰島β細胞對某些在該細胞中選擇表達的基因進行調控，對這些基因的調控是通過轉錄控制機制來完成的[11]，這涉及普遍存在的整合機制以及細胞的轉錄因子[12]。GPR40基因選擇性地表達在胰島β細胞，它對胰島素分泌起到了重要作用。

研究證實TCF7L2與GPR40與T2DM顯著相關。轉錄因子TCF7L2可以通過改變Wet信號途徑來直接影響胰島β細胞的生物學功能，而且TCF7L2也可以間接引起腸胰島軸的功能缺陷，包括GLP-1的分泌減少和GLP-1所誘導的胰島素分泌缺陷和(或)功能障礙。但是，GPR40是通過何種途徑調節(jié)胰島素的分泌以及胰島β細胞功能目前尚不清楚。Del Guerra等[13]研究發(fā)現脂肪酸調節(jié)了人類胰島中的GPR40的表達，T2DM患者胰腺中的GPR40的表達量較正常人少，胰島素的分泌以及胰島β細胞功能的異常均與GPR40有關。Kebede等[14]認為GPR40不僅能夠在脂肪酸刺激的胰島素分泌中起作用，而且在高脂飲食的情況下對葡萄糖刺激的胰島素分泌也起作用。Naqasumi等[15]研究發(fā)現GPR40可以調節(jié)葡萄糖刺激的胰島素分泌以及體內的血漿葡萄糖水平，同時可以提高普通小鼠以及糖尿病小鼠的糖耐量。Thierry等[16]研究發(fā)現GPR40的缺失可以降低胰島素的分泌，其機制并不是通過影響脂肪酸刺激的胰島素分泌，而是減少了葡萄糖以及精氨酸刺激的胰島素分泌，其機制是通過影響肌醇磷酸類的產生。Pang等[17]則認為GPR40介導的胰島素的分泌，部分是由于刺激了腎上腺素受體所引起的。然而GPR40基因啟動子是否與轉錄因子TCF7L2相互結合，從而影響胰島素的分泌，目前未見相關報道。

已經證實GPR40與轉錄因子PDX-1存在特異性結合位點。為了探討轉錄因子TCF7L2是否對GPR40基因直接起作用，本研究以TCF7L2抗體免疫沉淀TCF7L2結合的染色質片段，PCR擴增出GPR40基因，該結果證實TCF7L2可與GPR40基因調控區(qū)結合，為TCF7L2參與GPR40表達調控提供了強有力的證據。本研究為GPR40如何參與胰島素分泌找到了新的依據。但是TCF7L2是如何參與GPR40表達調控還需進一步研究。

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