小鼠中腦神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的研究*

肖 莉，石清明，畢文杰，蘇炳銀△

(1.成都醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室/發(fā)育與再生四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610083；2.成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心,成都 610021)

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)是具有自我更新能力和多向分化潛能的一類細(xì)胞。隨著NSCs鑒定、誘導(dǎo)、遷移、整合等技術(shù)的成熟，使得NSCs移植治療帕金森病等神經(jīng)變性疾病成為可能，且具有巨大的發(fā)展和應(yīng)用前景[1]。中腦源性NSCs因具有向多巴胺能神經(jīng)元分化的潛能，已成為近年來興起并得到快速發(fā)展的干細(xì)胞移植治療帕金森病的理想種子細(xì)胞[2]。已有許多研究小組報(bào)道了大鼠、小鼠和人胚胎中腦NSCs的分離和培養(yǎng)方法，但對新生小鼠中腦NSCs的分離培養(yǎng)方法則鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)分別采用機(jī)械法和酶消化法對出生1～3 d的小鼠中腦NSCs進(jìn)行了分離、培養(yǎng)和免疫組織化學(xué)鑒定，為研究NSCs增殖分化及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 出生1～3 d的昆明種小鼠SPF級(jí)，由成都醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2主要試劑 DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基、胎牛血清(Hycolne公司)，B27因子(Gibco，美國)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibrob last growth factor，bFGF)(Peprotech Inc，美國)；NSCs標(biāo)志物抗巢蛋白(Nestin)多克隆抗體、神經(jīng)元標(biāo)志物抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)多克隆抗體、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary noidic protein，GFAP)多克隆抗體、SABC免疫組織化學(xué)試劑盒(均購自Boster公司)；0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA購自Hycolne公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3方法

1.3.1NSCs的分離、培養(yǎng)及傳代 取出生1～3 d昆明種小鼠，脫頸椎處死后，浸入75%乙醇中5～10 min，用含有雙抗的PBS液浸洗2～3次。在超凈臺(tái)中剝離顱骨，無菌條件下取出腦組織，解剖顯微鏡下，仔細(xì)分離中腦組織，剝離腦膜和血管，PBS液浸洗，置于無菌培養(yǎng)皿中，采用機(jī)械法和酶消化法2種分離培養(yǎng)方法。(1)機(jī)械法：用眼科剪將中腦組織反復(fù)剪碎，加入DMEM/F12培養(yǎng)基，混勻后移至離心管中，用吸管反復(fù)吹打5～10 min，制成單細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心10 min，去除上清液，加入DMEM/F12培養(yǎng)基，經(jīng)200目尼龍濾網(wǎng)過濾，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL,接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)基中加入2% B27和20 ng/mL bFGF，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d半定量換液，7 d傳代。(2)酶消化法：用眼科剪反復(fù)剪碎中腦組織后，加入0.25%胰酶-0.02%EDTA(1∶1)的消化液(覆蓋組織為宜)，37 ℃的培養(yǎng)箱中消化5～8 min，加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，吸管吹打混勻，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入DMEM/F12培養(yǎng)基，經(jīng)200目尼龍濾網(wǎng)過濾，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，在DMEM/F12培養(yǎng)基中加入2% B27和20 ng/mL bFGF，其余培養(yǎng)方法同前。原代培養(yǎng)第7天，在低倍鏡(×100)下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，對上述2種方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。原代培養(yǎng)第7天，用吸管反復(fù)吹打瓶底，將液體移入離心管中，1 000 r/min離心5 min，吸棄上清液，加入DMEM/F12培養(yǎng)基，2% B27和20 ng/mL bFGF，將神經(jīng)球吹打成單個(gè)細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)，以5×105/mL密度接種于培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔5～7天傳代1次。

1.3.2NSCs的誘導(dǎo)分化 將生長狀態(tài)良好的第2代NSCs，吸管反復(fù)吹打，離心后用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，接種于6孔板中，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀況。誘導(dǎo)分化7 d后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

2 結(jié) 果

2.1機(jī)械法與酶消化法對原代細(xì)胞生長的影響 原代培養(yǎng)至24 h后，兩組細(xì)胞均呈懸浮生長，圓形，大小不等，胞體透明，可見少量細(xì)胞碎片。72 h后細(xì)胞碎片增多，部分懸浮生長的細(xì)胞分裂或聚集為細(xì)胞團(tuán)，即為神經(jīng)球。每個(gè)神經(jīng)球由2～4個(gè)到數(shù)十個(gè)細(xì)胞組成(封2圖1)。原代細(xì)胞不斷增殖，培養(yǎng)至5～7 d，培養(yǎng)基中可見胞體較大，圓形或橢圓形的神經(jīng)球，其邊界清楚，折光性強(qiáng)。每個(gè)神經(jīng)球是由十個(gè)至數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成，細(xì)胞排列緊密，呈“桑葚胚樣”(封2圖2)。在低倍鏡(×100)下觀察神經(jīng)球的數(shù)量，機(jī)械法的細(xì)胞球的數(shù)量(34.4±2.07)明顯高于酶消化法(24.6±2.88)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且酶消化法可見較多的細(xì)胞碎片和部分貼壁細(xì)胞。

2.2傳代培養(yǎng) 原代細(xì)胞培養(yǎng)第6～7天，由于細(xì)胞體積較大，中央部由于缺乏營養(yǎng)而影響細(xì)胞的生長，因此需要及時(shí)傳代。采用酶消化法，發(fā)現(xiàn)隨著傳代次數(shù)的增加，神經(jīng)球數(shù)量無明顯增加，部分神經(jīng)球出現(xiàn)貼壁分化，少數(shù)體積較大的細(xì)胞由于中央缺乏營養(yǎng)，神經(jīng)球增殖力明顯減弱。采用機(jī)械吹打法，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，可傳至第5代。

2．3NSCs的鑒定 將原代培養(yǎng)7 d的神經(jīng)球進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)神經(jīng)球在含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，2～3 h即可貼壁，神經(jīng)球Nestin免疫反應(yīng)呈陽性(封2圖3、4)。在高倍鏡(×200)下觀察，機(jī)械法的陽性神經(jīng)球的數(shù)量(14.2±1.92)顯著高于酶消化法(8.2±2.17)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2．4NSCs誘導(dǎo)分化細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 將原代或傳代培養(yǎng)7 d的神經(jīng)球在有血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化，2～3 h貼壁，4～5 d后可見細(xì)胞從神經(jīng)球中遷移出來，胞體呈星形、錐體形或不規(guī)則形(封2圖5)。繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞伸出突起，7～9 d后突起相互交織成網(wǎng)狀(封2圖6)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示GFAP或NSE免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞(封2圖7、8)。

3 討 論

NSCs是一種具有自我增殖及多向分化潛能的前體細(xì)胞，近年來已成為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病和損傷性疾病的新途徑[3-6]。研究發(fā)現(xiàn)，NSCs不僅存在于胚胎發(fā)育階段，而且終生存在；不僅存在于最初認(rèn)為的兩個(gè)生發(fā)區(qū)(腦室下區(qū)和海馬顆粒下區(qū))，還存在于中腦、皮層等腦區(qū)。目前，絕大多數(shù)研究是從小鼠、大鼠和人的胚胎腦中分離培養(yǎng)中腦NSCs。但前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)采用胚胎小鼠存在操作方法復(fù)雜、容易導(dǎo)致污染，且中腦組織相對量較少、分離取材部位不易明確等缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選用出生1～3 d的小鼠，成功培養(yǎng)出中腦組織NSCs，具有操作簡單、重復(fù)性好的特點(diǎn)。

細(xì)胞分離分別采用機(jī)械法和酶消化法。實(shí)驗(yàn)初期用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化中腦組織。細(xì)胞培養(yǎng)72 h，可見懸浮生長的神經(jīng)球，但數(shù)量較少。隨著傳代次數(shù)的增加，神經(jīng)球數(shù)量無明顯增加，部分神經(jīng)球出現(xiàn)貼壁分化，少數(shù)體積較大的細(xì)胞由于中央缺乏營養(yǎng)，神經(jīng)球增殖力明顯減弱。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)酶消化法對時(shí)間的控制非常嚴(yán)格，消化時(shí)間最好控制在5～8 min，若消化時(shí)間過長即出現(xiàn)消化液的顏色變得清亮，無組織碎塊，會(huì)影響細(xì)胞的生長，甚至由于細(xì)胞碎片較多而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外，NSCs表面具有多種生長因子受體，酶消化作用于細(xì)胞表面可能會(huì)損傷部分細(xì)胞膜受體[7]。而機(jī)械法操作步驟簡便，減少了胰蛋白酶及反復(fù)離心對細(xì)胞的損傷，免疫組織化學(xué)顯示原代培養(yǎng)第7天的細(xì)胞巢蛋白染色陽性，且神經(jīng)球的數(shù)目明顯高于酶消化法，傳代后細(xì)胞生長狀態(tài)良好，有利于今后誘導(dǎo)分化及細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)中對于神經(jīng)球數(shù)量的要求。

目前，NSCs多采用無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，目的是去除血清中可能誘導(dǎo)NSCs分化的生長因子等干擾因素。同時(shí)需添加神經(jīng)營養(yǎng)添加劑，B27含有必需脂肪酸、抗氧化劑、維生素等成分，是無血清培養(yǎng)基的理想添加劑[8]。此外，還需添加促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的生長因子，已證實(shí)bFGF對NSCs增殖的早期階段發(fā)揮促有絲分裂的作用[9]。本實(shí)驗(yàn)采用含有2% B27和20 ng/mL bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基，成功地培養(yǎng)出了中腦NSCs。

巢蛋白是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)元中間絲蛋白，其表達(dá)始于神經(jīng)胚形成時(shí)，成熟的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中無此蛋白，是目前最常用的NSCs特異性分子標(biāo)志[10-15]。本實(shí)驗(yàn)對貼壁2～3 h的神經(jīng)球行Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)果顯示呈陽性反應(yīng)。當(dāng)加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4～5 d后，神經(jīng)球發(fā)生貼壁分化，免疫細(xì)胞化學(xué)顯示NSE和GFAP呈陽性。表明獲得的細(xì)胞為NSCs，具有分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞潛能的NSCs。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功分離培養(yǎng)出新生小鼠中腦NSCs，并觀察其生物學(xué)特性。在以后的研究中，將重點(diǎn)探討中腦NSCs體外定向誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元

的條件，分析其調(diào)控機(jī)制，為其作為種子細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)移植治療帕金森病提供實(shí)驗(yàn)學(xué)基礎(chǔ)。

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