杭州地區(qū)原料奶中嗜冷菌的分離鑒定

呂元，葉興乾

（1.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，杭州 310018；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程和食品學(xué)院，杭州 310029）

杭州地區(qū)原料奶中嗜冷菌的分離鑒定

呂元1，葉興乾2

（1.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，杭州 310018；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程和食品學(xué)院，杭州 310029）

以杭州地區(qū)牧場的原料奶為實(shí)驗(yàn)對象，對原料奶受嗜冷菌污染情況進(jìn)行調(diào)研，并對其中的嗜冷菌進(jìn)行分離鑒定，確定革蘭氏陰性嗜冷菌占絕大部分，其中熒光假單胞菌、魯氏不動(dòng)桿菌、阪崎腸桿菌為優(yōu)勢嗜冷菌種，為進(jìn)一步研究出一種快速檢測原料奶嗜冷菌的方法奠定理論基礎(chǔ)。

原料奶；嗜冷菌；調(diào)研；分離鑒定；優(yōu)勢菌群

0 引言

食品微生物領(lǐng)域中嗜冷菌是指：0～7℃下能夠生長并在7～10 d內(nèi)產(chǎn)生可見菌落的一類微生物。

原料奶在低溫冷藏時(shí)會(huì)受到嗜冷菌的污染。嗜冷菌大量繁殖并產(chǎn)生耐熱的脂肪酶和蛋白酶。這些酶經(jīng)過高溫滅菌階段還會(huì)有少量殘留，在成品奶制品儲(chǔ)藏過程中繼續(xù)分解其中的脂肪和蛋白質(zhì)，導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)發(fā)生變化。而傳統(tǒng)的嗜冷菌檢測方法耗時(shí)長，不能及時(shí)的反映原料奶受嗜冷菌污染的程度。要控制原料奶的嗜冷菌污染，就要研究出原料奶中嗜冷菌在低溫冷藏時(shí)的生長規(guī)律，確定其中的優(yōu)勢菌群。

本文對杭州地區(qū)原料奶中的嗜冷菌進(jìn)行分離鑒定，并明確了不同時(shí)期原料奶中嗜冷菌的優(yōu)勢菌群，為生產(chǎn)上有效控制嗜冷菌數(shù)量、減少其對乳制品的危害、提高乳品質(zhì)量和安全性提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 原料

本試驗(yàn)供試原料為產(chǎn)自杭州周邊地區(qū)10個(gè)分散小牧場的原料奶，取樣時(shí)間為2008年10月至2009年8月，每月取樣1次。

1.2 主要試劑與儀器

培養(yǎng)基：葡萄糖1.0 g，酵母提取物2.5 g，脫脂奶粉1.0 g，胰蛋白胨5.0 g，瓊脂粉10～15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為6.8～7.0，蛋白胨，革蘭氏染色液。

儀器：潔凈工作臺(tái)，恒溫水浴鍋，高壓滅菌鍋，電熱烘箱，生化培養(yǎng)箱，千分之一天平，光學(xué)顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

從2008年10月至2009年8月，每月到10個(gè)牧場取樣1次，無菌取樣50 mL于經(jīng)輻照滅菌的無菌離心管中，每個(gè)樣品取3管，并作好標(biāo)記。將取好的樣品置于低溫保溫箱中，送回至實(shí)驗(yàn)室于4℃冰箱中保存。

1.3.2 培養(yǎng)基的制備

按培養(yǎng)基成分表中的成分比例稱量各組分，用蒸餾水配成溶液，置于高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌（121℃，20 min）。將滅好菌的培養(yǎng)基冷卻至45℃左右時(shí)，倒入無菌平板（經(jīng)180℃，2 h干熱滅菌）中留用。

1.3.3 無菌蛋白胨水的制備

稱量10 g蛋白胨溶于1 000 mL蒸餾水中，再分裝于試管和廣口瓶中，每支試管量取9 mL，廣口瓶225 mL，121℃，20 min滅菌。

1.3.4 樣品稀釋

取將10個(gè)牧場的原料奶樣品，編號(hào)1-10，并將每一份原料奶樣品進(jìn)行梯度稀釋。以1號(hào)原料奶樣品為例：取原料奶樣品25 mL，加入225 mL的1%蛋白胨水稀釋液中，稀釋至10-1倍；從10-1倍稀釋液中取1 mL，加入9 mL稀釋液中，稀釋至10-2倍；按此方法將樣品稀釋至10-8。2-10號(hào)樣品的稀釋同1號(hào)樣品。

1.3.5 接種與培養(yǎng)

以1號(hào)原料奶樣品為例，先取10-4，10-5，10-6，10-7稀釋度，每個(gè)稀釋度取1 mL樣液均勻涂布在已倒好的培養(yǎng)基的平板中，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行樣，置于7℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。同時(shí)做空白對照樣。2-10號(hào)按此方法進(jìn)行。

1.3.6 嗜冷菌的分離純化

仔細(xì)觀察平板中各菌的菌落形態(tài)，觀察菌落大小、形狀、色澤、色素產(chǎn)生、表面光滑程度、邊緣整齊度，并結(jié)合各菌種的革蘭氏染色情況進(jìn)行嗜冷菌的分離。將不同菌落形態(tài)的嗜冷菌菌落編號(hào)并進(jìn)行純化，重復(fù)純化3次。

1.3.7 樣品送檢

將樣品送至省人民醫(yī)院微生物檢測中心，鑒定各菌種的歸屬。鑒定儀器為法國biosMerieumx(生物梅里埃）公司的VITEK系列全自動(dòng)微生物分析儀。

2 結(jié)果和討論

2.1 分離出的嗜冷菌革蘭氏染色結(jié)果和菌落形態(tài)

從10個(gè)牧場的3個(gè)季度的原料奶樣品中，一共分離出90株菌落形態(tài)各異的嗜冷菌，經(jīng)過省人民醫(yī)院微生物種屬鑒定，確定這90株菌分別歸屬于16個(gè)種屬的嗜冷菌。表1列出的是這16個(gè)種屬的嗜冷菌革蘭氏染色結(jié)果以及菌落形態(tài)。

2.2 嗜冷菌生理生化反應(yīng)圖譜

經(jīng)省人民醫(yī)院微生物檢測中心檢驗(yàn)，從鑒定菌種的生理生化圖譜可知：從10個(gè)牧場的原料奶樣品中共分離到90株嗜冷菌純菌種分屬于16個(gè)種屬，分別為熒光假單胞菌16株、阪崎腸桿菌16株、魯氏不動(dòng)桿菌15株、乳桿菌8株、少動(dòng)鞘氨醇單胞菌6株、藤黃微球菌4株、溶藻阮酸弧菌4株、大腸桿菌4株、銅綠假單胞菌3株、普通變形桿菌3株、蜂房哈夫尼菌2株、肺炎克雷伯菌2株、皮氏羅爾斯頓菌2株、親水氣單胞菌2株、中間腸桿菌2株和嗜熱地衣芽孢桿菌1株。其中13個(gè)種屬77株嗜冷菌是革蘭氏陰性菌，3個(gè)種屬13株嗜冷菌為革蘭氏陽性菌。由此可見在杭州地區(qū)的原料奶中，革蘭氏陰性嗜冷菌占嗜冷菌的絕大部分，且熒光假單胞菌、阪崎腸桿菌和魯氏不動(dòng)桿菌是原料奶中主要的優(yōu)勢菌，這也和國內(nèi)外的一些報(bào)道相吻合。

表1 分離出嗜冷菌的革蘭氏染色結(jié)果及菌落形態(tài)描述

此前的研究人員也從原料奶中分離出了嗜冷菌屬，結(jié)果顯示：由于不同地區(qū)由于氣候條件的差異，其原料奶中微生物的菌相構(gòu)成各不相同；同樣，同一地區(qū)，不同季節(jié)，原料奶中的微生物組成也不同。例如，劉敏以產(chǎn)自內(nèi)蒙古的原料奶為樣本，分離出來27株嗜冷菌，其中革蘭氏陰性嗜冷菌占大部分。分離出來的27株嗜冷菌中氣單胞菌屬7株，節(jié)桿菌屬4株，黃桿菌屬3株，巴斯德氏菌屬3株，乳球菌屬2株，變形菌屬1株，短桿菌屬1株，微球菌屬1株，片球菌屬1株，明串珠菌屬1株和待定菌屬4株[2]，其中氣單胞菌屬和節(jié)桿菌屬是優(yōu)勢的嗜冷菌群。而以吳石金以杭州燕牌乳業(yè)3月份至10月份的原料奶為樣本，分離出來16株嗜冷菌，其中10株為假單胞菌，4株為微球菌[3]，其中假單胞菌是優(yōu)勢的嗜冷菌群。所以說研究出本地區(qū)原料奶中的嗜冷菌的菌相組成以及優(yōu)勢菌群對于控制本地區(qū)嗜冷菌的污染具有重要意義。

2.3 各個(gè)牧場分離出來的嗜冷菌及其數(shù)量統(tǒng)計(jì)

表2是對10個(gè)牧場分離出來的嗜冷菌菌屬種類的統(tǒng)計(jì)表。

由表2可以看出，從各個(gè)牧場分離出來的嗜冷菌種類數(shù)是有所不同，但種類都比較多。熒光假單胞菌、魯氏不動(dòng)桿菌和阪崎腸桿菌在這10個(gè)牧場中均有檢出。在送至省人民醫(yī)院檢測的90株樣本中，這3種菌占了半數(shù)以上，由此可見，這3種菌是杭州地區(qū)牧場原料奶中主要的優(yōu)勢嗜冷菌群。

表2 各牧場分離出嗜冷菌種類統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表3 不同月份各牧場中檢測出來的嗜冷菌統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4 不同月份分離出來的嗜冷菌種類及其數(shù)量統(tǒng)計(jì)

表3列出了2008年10月至2009年8月在各牧場原料奶中檢測出來的嗜冷菌的種類。可以看出，每個(gè)月檢測出來的嗜冷菌種類有所不同，但是熒光假單胞菌、阪崎腸桿菌和魯氏不動(dòng)桿菌在每個(gè)月均有檢出。其他嗜冷菌都是在不同月份有檢出，但是檢出頻率沒有以上3種嗜冷菌高。圖1為2008年10月至2009年各8月各季度檢測出來此種嗜冷菌的牧場數(shù)量。

由圖1可以看出，2008年10月至12月，在10個(gè)牧場的原料奶中共檢測出嗜冷菌9種；2009年3月至2009年5月，共檢測出嗜冷菌7種；2009年6月至8月共檢測出嗜冷菌11種。在這10個(gè)牧場的原料奶中還檢測出腸桿菌，腸桿菌可以在低溫條件下生長，但其最適生長溫度為37℃左右，所以在2009年6月至8月這段時(shí)間比較容易存活，污染原料奶的幾率比較大。

熒光假單胞菌、阪崎腸桿菌和魯氏不動(dòng)桿菌在這3個(gè)季度均有檢出，而且檢出牧場數(shù)量也是最多了，也證明了這3種嗜冷菌是這一時(shí)間段杭州地區(qū)牧場原料奶中的優(yōu)勢嗜冷菌群。乳桿菌和藤黃微球菌這兩種革蘭氏陽性嗜冷菌只在少數(shù)幾個(gè)月份和牧場被檢測出來?？梢钥闯龊贾莸貐^(qū)的牧場中，革蘭氏陰性菌在原料奶中占有絕對的優(yōu)勢。

3 結(jié)論

從以上的研究中，可以得到如下結(jié)論：革蘭氏陰性菌占杭州地區(qū)牧場冷藏原料奶微生物的絕大部分。熒光假單胞菌、阪崎腸桿菌和魯氏不動(dòng)桿菌是原料奶中的優(yōu)勢嗜冷菌群。這為進(jìn)一步建立快速檢測原料奶中嗜冷菌的數(shù)量提供了理論基礎(chǔ)。

[1]MORITA R Y.Psychrophilic bacteria[J].Bacteriological Reviews, 1975，39(2)：144-167.

[2]劉敏.原料乳中嗜冷菌的分離鑒定及生物學(xué)特性的研究[D].內(nèi)蒙古,內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

[3]吳石金,何光華.原料乳嗜冷菌分離株微生物學(xué)特性研究[J].中國乳品工業(yè),2005，33(8)：4-6.

[4]于美艷,苗秀芬,于桂榮.巴氏殺菌（消毒牛奶）中低溫菌對產(chǎn)品保存期的影響[J].中國乳品工業(yè),1996，24(1)：36-37.

Isolation and identification species of psychrophilic microorganisms from raw milk provided by the pastures in Hangzhou district

LV Yuan1,YE Xing-qian2
(1.Zhejiang Economic&Trade Polytechnic,Hangzhou,310018,China;2.Zhejiang University,Hangzhou,310029,China)

This paper focused on isolation and identification species of psychrophilic microorganisms from raw milk provided by the pastures in Hangzhou district.Most of psychrophilic microorganisms in raw milk of Hangzhou district were Gram-negative psychrophilic microorganisms. Pseudomonas fluorescens、Acinetobacter lwoffii and Enterobacter sakazakii were dominant microorganisms.All of the resalts were the basis of set up a new rapid methods for dairy industry to detect the contamination of psychrophilic microorganisms in raw milk.

raw milk;psychrophilic microorganisms;research;isolation and identification;dominant microorganisms

TS252.41

A

1001-2230（2012）03-0043-04

2011-11-25

浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級(jí)科研課題《原料奶中嗜冷菌的快速檢測》（11QN12）資助。

呂元(1985-)，女，研究見習(xí)員，從事食品安全方面的研究。