乙酸鈉和丁酸鈉對奶牛乳腺脂肪酸合成相關基因的影響

孔慶洋，林葉，李慶章

（東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

乙酸鈉和丁酸鈉對奶牛乳腺脂肪酸合成相關基因的影響

孔慶洋，林葉，李慶章

（東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

采用熒光定量RT-PCR方法，探討了外源添加乙酸鈉和丁酸鈉，對乳腺上皮細胞中乳脂肪酸合成的關鍵酶基因的影響，并采用半自動生化分析儀檢測了添加乙酸鈉和丁酸鈉后培養(yǎng)體系中三?；视蜐舛鹊淖兓?，確定了體外調控乳脂肪酸生物合成的最佳乙酸鈉濃度為16 mmol/L，最佳丁酸鈉濃度為0.75 mmol/L，為人工調控乳成分的合成提供了理論依據(jù)。

乙酸鈉；丁酸鈉；乳脂肪酸合成；FAS；ACC

0 引言

乳腺脂代謝的重要調節(jié)發(fā)生在mRNA水平，其中乙酰輔酶a羧化酶（ACC）是脂肪酸內源合成途徑的限速酶，脂肪酸合酶（FAS）是一種多功能復合酶，對控制動物體脂沉積具有重要的意義。目前，很多研究都集中在添加日糧或用動靜脈物質濃度差和血流量的方法,來調控乳脂的合成[2],但國內外在mRNA水平上研究添加乙酸和丁酸對乳脂合成的影響尚未見報道。本實驗研究乙酸鈉和丁酸鈉對奶牛乳腺上皮細胞兩種脂肪酸合成關鍵酶ACC和FAS在mRNA水平的影響和對乳脂合成能力的作用，旨在篩選出調控乳脂肪生物合成的最佳前體物濃度，為進一步提高乳質量和乳產量提供理論依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 奶牛乳腺上皮細胞的原代培養(yǎng)及鑒定

取泌乳期乳腺組織塊，置于含有培養(yǎng)液的小瓶中，在超凈臺上分離修剪，洗凈血凝塊，盡量剝離實體組織和結締組織，將呈白色顆粒狀的腺泡組織盡量剪碎，置于I型膠原酶中，37℃消化3.5～4 h，400目篩網(wǎng)過濾，D-Hank’s液清洗濾出液直至上清液無混濁物，將細胞沉淀以適量的密度接種于培養(yǎng)瓶中，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[3]。乳腺細胞從組織塊周圍生長，單層細胞融合至培養(yǎng)瓶底壁90%左右，吸出原有培養(yǎng)液，根據(jù)上皮細胞與成纖維細胞對胰蛋白酶消化敏感性不同純化乳腺上皮細胞[4,5]。應用免疫熒光細胞染色法檢測純化后乳腺上皮細胞中角蛋白18的表達情況，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.2 乙酸鈉和丁酸鈉的添加

待穩(wěn)定培養(yǎng)24 h的細胞融合度達到70%～80%時開始在細胞培養(yǎng)液中添加不同濃度的乙酸鈉和丁酸鈉，乙酸鈉濃度設定為：0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.0mmol/L，每組3個平行；丁酸鈉濃度設定為0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.25mmol/L，每組3個平行[6]。培養(yǎng)24h后收集乳腺上皮細胞和培養(yǎng)液，分別進行熒光定量RT-PCR檢測和甘油三酯濃度測定。

1.2.3 mRNA水平表達的檢測

采用TRlzol試劑提取乳腺上皮細胞中總RNA，使用甲醛變性凝膠電泳的方法檢測RNA可用，使用Primer5.0進行PT-PCR法檢測所需要的引物設計（表1）。RNA經過反轉錄后使用TaKaTa公司的SYBRPrime-ScriptTMEx TagTM試劑盒進行熒光定量PCR實驗，溶解曲線分析，每個基因進行3個平行實驗。實驗數(shù)據(jù)以軟件導出，采用2-△△ct相對定量方法進行計算。

表1 引物序列

1.2.4 胞外三?；视偷臏y定

按照說明書配制反應溶液，以546 nm為主波長測定吸光度，根據(jù)公式：三油甘脂濃度=（A樣品÷A校準）×標準濃度，計算三?；视蜐舛取?/p>

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

實驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)表示為平均值（X）±標準誤（SE）。

2 結果

2.1 奶牛乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)及鑒定

本研究選取泌乳期荷斯坦奶牛乳腺組織，通過組織塊培養(yǎng)法進行乳腺上皮細胞的原代培養(yǎng)，每2 d換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)至10 d左右乳腺組織塊周圍出現(xiàn)乳腺上皮細胞（圖1）。

應用免疫熒光方法檢測純化后的乳腺上皮細胞中角蛋白18的表達，激光共聚焦顯微鏡觀察。結果顯示：乳腺上皮細胞中角蛋白18的表達呈陽性（圖2）。綠色熒光為表達于細胞質中的角蛋白18，紅色為PI染色的細胞核。

2.2 添加乙酸鈉對基因表達及TG合成的影響

采用熒光定量RT-PCR方法檢測乳腺上皮細胞中羧化酶（ACC）和FAS mRNA的表達，采用半自動生化分析儀檢測培養(yǎng)體系中TG濃度的變化，結果如表2所示。與未添加丁酸鈉的乳腺上皮細胞相比，當乙酸鈉濃度為16 mmol/L時，乳腺上皮細胞內脂肪酸合酶（FAS）基因表達量增加437%，ACC基因表達量增加727%，乳腺上皮細胞分泌的TG增加30%（P＜0.05）。

2.3 添加丁酸鈉對基因表達以及TG合成的影響

表3為不同濃度丁酸鈉對奶牛乳腺上皮細胞FAS、ACCmRNA表達及TG合成的影響。由表3可以看出，與未添加丁酸鈉的乳腺上皮細胞相比，當丁酸鈉濃度為0.75 mmol/L時，F(xiàn)AS基因表達量增加432%，ACC基因表達量增加720%，乳腺上皮細胞胞外分泌的TG增加27%（P＜0.05）。

表2 不同濃度乙酸鈉對奶牛乳腺上皮細胞FAS、ACCmRNA表達及TG合成的影響

表3 不同濃度丁酸鈉對基因表達及TG合成的影響

3 討論

在乳腺中，乳脂的合成發(fā)生在乳腺上皮細胞滑面內質網(wǎng)的表面。乳脂合成中所需的C4～C10脂肪酸100%由乳腺上皮細胞從頭合成，因此脂肪酸從頭合成的原料乙酸和丁酸對泌乳期奶牛的乳脂合成尤為重要。乙酸和丁酸是由瘤胃合成后進入血液的主要揮發(fā)性脂肪酸，經乳腺吸收后被乳腺上皮細胞用來重新合成短鏈脂肪酸，進而用于合成乳脂肪三?；视蚚10-11]。乳腺上皮細胞脂肪酸的合成主要由2種酶催化，ACC和FAS。本實驗結果顯示，添加乙酸鈉和丁酸鈉后，乳腺上皮細胞中ACC和FAS的表達顯著增加，在高峰期大約是未添加細胞的5～8倍。ACC是動物體中調節(jié)脂肪酸合成的限速酶，與脂肪酸的從頭合成密切相關,其活性在多個水平被調節(jié)。它的基因在兩個不同品系奶牛的泌乳期乳腺中表達不同[10]，表明這個基因在泌乳期脂肪酸合成中直接發(fā)揮作用。FAS它催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A而生成長鏈FA。它由兩條相同的多肽組成，每條多肽有2500個氨基酸殘基和7個活性位點，具有功能活性的FAS以從頭到尾的昂表現(xiàn)為二聚體形式。FAS基因的表達直接影響著脂肪酸合成酶的多寡，對控制動物體脂沉積有重要意義。乙酸鈉和丁酸鈉能夠增加兩種基因的表達，促進組成乳脂重要的甘油三酯分別增加，進而增強乳腺上皮細胞的泌乳能力。

本研究在乳腺上皮細胞中分別添加不同濃度的乙酸鈉和丁酸鈉，并通過RT-PCR方法檢測了乳脂肪酸合成關鍵基因ACC和FAS mRNA水平的表達變化，確定體外培養(yǎng)體系中調控乳脂肪酸合成的最佳乙酸鈉濃度為16 mmol/L，最佳丁酸鈉濃度為0.75 mmol/L，此時乳腺上皮細胞三?；视偷暮铣闪孔罡摺?/p>

[1]南雪梅,曲波,李慶章，等.奶山羊乳腺物質代謝研究[D].東北農業(yè)大學,2010（12）:11-18.

[2]程光民.反芻家畜乳脂合成營養(yǎng)調控研究[D].山東農業(yè)大學.2005 (6):15-20.

[3]陳建暉,佟慧麗,李慶章，等.奶牛乳腺上皮細胞系的建立[J].畜牧獸醫(yī)學報,2009（5）:743-747.

[4]WELLNITZ O,KERR D E.Cryopreserved Bovine Mammary Cells to Model Epithelial Response to Infection[J].Vet Immunol Immunopathol,2004,101(3-4):191-202.

[5]SAKAMOTO K,KOMATSU T,KOBAYASHI T,et al.Growth Hmrmone Acts on the Synthesis and Secretion of Alpha-casein in Bovine Mammary Epithelial Cells[J].J.Dairy Res,2005,72(3):264-270.

[6]LPEZ-LUNA P,MAIER I,HERRERA E.Carcass and Tissue Fat Content in the Pregnant Rat[J].Biol.Neonate,1991,60:29-38.

[7]GRIINARI J M,CORL B A,LACY S H，et al.Conjugated Linoleic Acid is Synthesized Endogeneously in Lactating Dairy Cows by Deta-9 Desaturase[J].J.Nure,2000,30:2285-2291.

[8]BRISKEN C,HEINEMAN A,CHAVARRIA T,et al.Essential Function of Wnt-4 in Mammary Gland Development Downstream of Progesterone Signaling[J].Genes Dev,2000,14:650-654.

[9]SHIMANOH.SterolRegulatoryElement-bindingProteins (SREBPs):Transcriptional Regulators of Lipid Regulators of Lipid Synthetic Genes[J].Progress in Lipid Research,2001,40(6):439-452.

[10]SILLINGFORD J M,HENNIGHAUSEN L.Experimental Mouse Genetics-answering Fundamental Questions about Mammary Gland Biology[J].Trends Endocrinol Metab,2001,12(9):402-408.

[11]BAUMGARD L H,MATITASHVILI E,CORL B A,et al.Trans-10,Cis-12 Conjugated Linoleic Acid Decreases Lipogenic Rates and Expression of Genes Involved in Milk Lipid Synthesis in Dairy Cows [J].J.Dairy,2002：2155-2163.

Influence on cow breast fatty acid biosynthesis related genes with sodium acetate and sodium butyrate

KONG Qing-yang，LIN Ye，LI Qing-zhang
(Northest Agricultural University,Harbin 150030,China)

Using fluorescence quantitative RT-PCR method,explored the effects of exogenous additives sodium acetate and sodium butyrate on gene expression of the key enzymes in milk fatty acid synthesis in mammary epithelial cells of dairy cow.And using semi-automatic biochemical analyzer detected the triacylglycerol concentration after adding sodium acetate and sodium butyrate in culture system,determined that the optimal sodium acetate was 16 mmol/L and sodium butyrate was 0.75 mmol/L regulating the biosynthesis of milk fat in vitro,provided a theoretical basis for artificial regulation of milk components.

sodium acetate;sodium butyrate;milk fatty acid synthesis；FAS；ACC

TS252.1

A

1001-2230（2012）03-0015-03

2011-10-18

國家高技術研究和發(fā)展863計劃（2006AA10Z1A4），東北農業(yè)大學創(chuàng)新團隊計劃（CXT005-1-1/2）。

孔慶洋（1986-）女，碩士，從事泌乳生物學與乳腺功能調控研究。

李慶章