Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 和Streptococcus thermophilus接種比例對Bifidobacterium lactis益生菌發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

李慧，白梅，王記成，魏愛彬，孔亞楠，張和平，孫天松

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，呼和浩特 010018）

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 和Streptococcus thermophilus接種比例對Bifidobacterium lactis益生菌發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

李慧，白梅，王記成，魏愛彬，孔亞楠，張和平，孫天松

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，呼和浩特 010018）

將Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusND02（LB-ND02）和Streptococcus thermophilusND03（ST-ND03）按1∶1、1∶10、1∶100、1∶1000接種于脫脂乳中，同時接入益生菌Bifidobacterium lactisV9（B.lactisV9，接種量為2.0×107g-1），于42℃進(jìn)行發(fā)酵。通過對發(fā)酵及貯藏過程中發(fā)酵乳指標(biāo)的測定，評價LB-ND02和ST-ND03的接種比例對發(fā)酵乳品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，隨著LB-ND02接種比例減小，凝乳時間顯著延長，B.lactisV9活菌數(shù)顯著提高。4℃貯藏28 d后，隨LB-ND02接種比例減小，B.lactisV9存活率差異顯著，后酸化也顯著減弱。研究發(fā)現(xiàn)，LB-ND02和ST-ND03的接種比例，顯著影響發(fā)酵乳的發(fā)酵時間、B.lactisV9活菌數(shù)、后酸化及黏度。

Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusND02；Streptococcus thermophilusND03；Bifidobacterium lactisV9；益生菌發(fā)酵乳品質(zhì)

0 引言

益生菌發(fā)酵乳品質(zhì)受發(fā)酵劑、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、貯藏條件等因素影響[1]。酸度、黏度、持水性、益生菌活菌數(shù)等是評價發(fā)酵乳品質(zhì)的重要指標(biāo)，尤其是益生菌的活菌數(shù)，是發(fā)揮益生特性的重要保證[2-3]。已發(fā)現(xiàn)貨架期內(nèi)一些產(chǎn)品中益生菌的活菌數(shù)低于106g-1[4-7]。研究表明，菌株特性、后酸化、發(fā)酵劑、溶氧量及貯藏條件等對其活菌數(shù)均有影響[8-11]。

Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusND02和Streptococcus thermophilusND03分離自傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，并完成了基因組全序列測定，二者具有應(yīng)用于發(fā)酵乳中良好的潛質(zhì)[12-13]。Bifidobacterium lactisV9（B.lactisV9）分離自健康蒙古族兒童糞便，具有良好益生特性的益生菌，已經(jīng)完成的基因全序列的測定[14-17]。

本研究通過改變保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的接種比例，探討其對益生菌發(fā)酵乳品質(zhì)的影響。

1 實驗

1.1 材料和儀器

Bifidobacterium lactisV9、Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusND02、Streptococcus thermophilusND03均為直投式發(fā)酵劑。脫脂乳粉。

MRS合成培養(yǎng)基，Eppendorf TGL-168高速臺式離心機(jī)，pH計（雷磁PHS-3C，生化培養(yǎng)箱(LRH-250)，無菌工作臺（NSC-ⅡA-1200），全自動高壓滅菌器（HIRAYAMA HA-300M），Brookfield DV-1 VISCOMETER黏度儀。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

將脫脂乳粉于45～50℃軟化水中完全溶解，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11%還原乳，95℃5min殺菌，冷卻至42℃，按表1的接種量接入LB-ND02和ST-ND03，并以2.0× 107g-1接入B.lactisV9，于42℃恒溫發(fā)酵至pH值4.5終止發(fā)酵，4℃貯藏28 d。

表1 發(fā)酵乳中LB-ND02和ST-ND03的接種量（g-1）

1.2.2 發(fā)酵乳發(fā)酵及貯藏特性

發(fā)酵乳在42℃發(fā)酵及4℃28 d貯藏過程中，定期取樣測定發(fā)酵乳樣品pH值、滴定酸度（TA）、游離氨基氮（FAN）濃度、黏度、脫水收縮性及活菌數(shù)。

1.2.2.1 pH值測定

調(diào)整試驗樣品溫度至20℃，采用精密pH計（雷磁PHS-3C）測量。

pH降低率：pH-DR=（pH始-pH終）/發(fā)酵時間。

1.2.2.2 滴定酸度測定

滴定酸度按GB5413.34-2010中方法測定[18]。

滴定酸度增加率為TA-IR=（TA終-TA始）/發(fā)酵時間。

1.2.2.3 游離氨基氮含量測定

游離氨基氮（FAN）的測定采用鄰苯二甲醛衍生比色法，參照Lemieux[19]和Church[20]等人的方法。

游離氨基氮增加率：FAN-IR=（FAN終-FAN始）/發(fā)酵時間。

1.2.2.4 黏度測定

調(diào)整發(fā)酵乳樣品溫度至20℃，采用Brookfield DV-1 VISCOMETER黏度儀(Brookfield Engineering Laboratories,Inc,Middleboro,MA)4#轉(zhuǎn)子進(jìn)行測定，其中轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為100 r/min，扭矩為10%～100%，測定時間為30 s。

1.2.2.5 脫水收縮性的測定

稱取20.0 g發(fā)酵乳樣品，置于帶有濾紙（雙圈牌中速定性濾紙）的漏斗中，4℃放置120 min，收集濾液并稱重[21]。

脫水收縮性（%）=（濾液質(zhì)量/樣品質(zhì)量）×100。

1.2.2.6 活菌數(shù)測定

取1.0 g發(fā)酵乳樣品用滅菌PBS水溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%的NaCl，0.02%的KH2PO4，0.115%的Na2HPO4，0.05%的半胱氨酸）梯度稀釋至一定倍數(shù)后，分別采用選擇培養(yǎng)基平板傾注法測定LB-ND02、ST-ND03和B.lactisV9的活菌數(shù)。

Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusND02的選擇培養(yǎng)采用文獻(xiàn)[22]中的方法，MRS固體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為4.58，43℃厭氧培養(yǎng)72 h。

Streptococcus thermophilusND03的選擇培養(yǎng)采用文獻(xiàn)[23]中的方法，ST固體培養(yǎng)基，37℃需氧培養(yǎng)24 h。

B.lactisV9的選擇培養(yǎng)采用國標(biāo)GB 4789.35-2010中改良MRS固體培養(yǎng)基平板傾注法[24]，37℃厭氧培養(yǎng)72 h。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個指標(biāo)的測定均做3個平行樣，采用SAS軟件的ANOVA程序進(jìn)行方差分析，采用origin7.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵期間及發(fā)酵終點不同接種比例對發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

LB-ND02與ST-ND03不同接種比例發(fā)酵乳在發(fā)酵期間pH值降低率（pH-DR）、滴定酸度增加率（TAIR）、游離氨基氮增加率（FAN-IR）及發(fā)酵時間、發(fā)酵終點酸度（TA終）、發(fā)酵終點游離氨基氮（FAN終）、發(fā)酵終點活菌數(shù)見表2。

隨LB-ND02接種比例的逐漸減小，發(fā)酵乳pH值降低率、滴定酸度增加率和游離氨基氮增加率顯著減?。≒＜0.05），發(fā)酵至終點（pH值為4.5）所需時間顯著延長（P＜0.05），發(fā)酵至終點B.lactisV9活菌數(shù)顯著增大（P＜0.05）。其中LB-ND02與ST-ND03按1∶1000和1∶100接種時，發(fā)酵終點發(fā)酵乳中B.lactisV9活菌數(shù)（對數(shù)值）分別為（8.32±0.02）g-1和（8.01±0.04）g-1，較接種時（7.30 g-1，對數(shù)值）分別增加10倍和5倍，而按比例為1∶10接種時活菌數(shù)基本沒有變化。由此可見，降低LBND02的接種量，使發(fā)酵乳酸化速率減緩，發(fā)酵時間延長，增加了B.lactisV9活菌數(shù)。

眾所周知，與兩者單獨培養(yǎng)相比，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合培養(yǎng)后的產(chǎn)酸速度非常快，因為混合培養(yǎng)過程將促進(jìn)兩者維持更好的生長[1]。Pette等人[25]證實保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳中無菌過濾物可以促進(jìn)嗜熱鏈球菌的生長。進(jìn)一步研究得出，刺激嗜熱鏈球菌生長的這種過濾物中富含氨基酸。而嗜熱鏈球菌生長產(chǎn)生的嘌呤、嘧啶、CO2、甲酸、草酰乙酸、富馬酸等可刺激保加利亞乳桿菌生長[1]。因此，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的比例會影響二者在發(fā)酵乳中的共生關(guān)系，從而影響產(chǎn)酸速率和發(fā)酵時間。本研究中，改變LB-ND02與ST-ND03的接種比例，顯著影響了發(fā)酵時間。這是由于降低LB-ND02的接種量時，其水解蛋白產(chǎn)生的游離氨基酸濃度減少，使與ST-ND03的共生能力趨于減緩，產(chǎn)酸較慢，發(fā)酵時間延長。

表2 發(fā)酵乳在發(fā)酵期間和發(fā)酵終點（pH4.5）酸度、FAN、發(fā)酵時間及活菌數(shù)結(jié)果(n=3,x±SD)

已有研究表明，雙歧桿菌因缺少蛋白質(zhì)水解活性，在乳中的生長受到一定限制，增加蛋白質(zhì)水解物或與蛋白質(zhì)水解能力強的菌株混合發(fā)酵，其活菌數(shù)可以得到有效的提高[26]。本研究中，LB-ND02與ST-ND03按1∶1接種時，發(fā)酵結(jié)束B.lactisV9活菌數(shù)（7.15 g-1，對數(shù)值）較接種時（7.30 g-1，對數(shù)值）略有降低。雖然此接種比例下較高的游離氨基氮可供B.lactisV9利用，但由于發(fā)酵時間（330 min）較短，B.lactisV9的生長受到限制；另一原因可能為LB-ND02產(chǎn)生的過氧化氫抑制了B.lactisV9的生長。Gilliland和Speck研究表明，保加利亞乳桿菌生長過程中會產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫會抑制雙歧桿菌糖代謝的關(guān)鍵酶—果糖-6-磷酸-磷酸酮酶（F6ppk），從而引起氧中毒[9]。從表2可知，當(dāng)LBND02與ST-ND03按1∶1000和1∶100接種時，發(fā)酵結(jié)束B. lactisV9的活菌數(shù)較高，這是由于此比例下，較少的LBND02接種量，對B.lactisV9的影響較小，且蛋白水解能力有限，使發(fā)酵乳中游離氨基氮濃度較低，延長了發(fā)酵時間，B.lactisV9得到了較好的生長。

2.2 貯藏期間不同接種比例對發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

LB-ND02與ST-ND03不同接種比例發(fā)酵乳在4℃貯藏28 d后pH值降低量、滴定酸度增加量如表3所示。由表3可以看出，隨LB-ND02接種比例減小，貯藏28 d后發(fā)酵乳pH值降低量和TA增加量顯著減小（P＜0.05）。可見，減少LB-ND02的接種量，可減緩發(fā)酵乳的后酸化現(xiàn)象。后酸化現(xiàn)象對發(fā)酵乳的品質(zhì)影響巨大，最直接的后果是導(dǎo)致發(fā)酵乳無法長期貯存，影響其正常消費。保加利亞乳桿菌細(xì)胞壁或細(xì)胞膜對乳糖酶活性有一定的保護(hù)作用，因此造成發(fā)酵乳在貯藏過程中乳糖繼續(xù)被利用，導(dǎo)致了后酸化現(xiàn)象發(fā)生[27]。本研究中，LB-ND02與ST-ND03接種比例為1∶1和1∶10發(fā)酵乳后酸化較強，不僅與其中LB-ND02接種量大有關(guān)，還與其發(fā)酵結(jié)束游離氨基氮濃度高有關(guān)，因為較高的游離氨基氮濃度會刺激ST-ND03的進(jìn)一步生長代謝，促進(jìn)酸的生成。LB-ND02與ST-ND03接種比例為1∶1000和1∶100發(fā)酵乳后酸化現(xiàn)象較輕，可滿足實際生產(chǎn)需求。

LB-ND02與ST-ND03不同接種比例發(fā)酵乳在4℃貯藏28 d期間黏度和脫水收縮性變化如圖1和圖2所示。發(fā)酵乳黏度呈波動下降趨勢，其中，LB-ND02和ST-ND03接種比例為1∶1時，發(fā)酵乳黏度顯著低于其他組（P＜0.05）。發(fā)酵乳的脫水收縮性均有輕微上升，但無顯著性的差異（P＞0.05）?？梢?，除LB-ND02與ST-ND03接種比例為1∶1外，其他接種比例不影響發(fā)酵乳的黏度；所有接種比例并不影響發(fā)酵乳脫水收縮性。發(fā)酵過程中發(fā)酵劑產(chǎn)生的胞外多糖類黏性物質(zhì)，有助于改善發(fā)酵乳的組織狀態(tài)和黏稠度，特別是在發(fā)酵乳干物質(zhì)含量不太高時尤為重要[1]。本研究中，LBND02與ST-ND03按1∶1比例接種，發(fā)酵乳黏度低于其他比例組，這是由于ST-ND03的接種量（1.1×106g-1）較其他比例組（2.2×106g-1）低的緣故。秦南冰等也得到類似的結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)增加嗜熱鏈球菌接種量可增加發(fā)酵乳黏度[28]。脫水收縮性是發(fā)酵乳凝膠對各種乳成分尤其是水分的結(jié)合能力，這種結(jié)合能力包括對結(jié)合水和凝膠立體網(wǎng)絡(luò)中自由水的結(jié)合能力，脫水收縮性越小說明凝膠在規(guī)定的時間內(nèi)失去的乳清越少[1]。脫水收縮性與發(fā)酵劑接種量有關(guān)，較大的接種量會使發(fā)酵乳產(chǎn)酸加快，蛋白水合能力減弱，導(dǎo)致貯藏過程中乳清析出[1]。本研究中所有比例組發(fā)酵乳脫水收縮性沒有差異，這是由于各比例組LB-ND02與STND03的初始接種量相同，發(fā)酵結(jié)束各比例組中LBND02與ST-ND03的活菌總數(shù)（見表2）基本相同。

LB-ND02與ST-ND03不同接種比例發(fā)酵乳在4℃貯藏28 d后LB-ND02、ST-ND03和B.lactisV9存活率如表3所示。LB-ND02與ST-ND03接種比例為1∶100發(fā)酵乳中，LB-ND02和ST-ND03的存活率（41.69%±0.14%和77.62%±0.20%）顯著高于其他比例組（P＜0.05）。LB-ND02與ST-ND03接種比例為1∶1發(fā)酵乳中B.lactisV9的存活率（23.44%±0.23%）顯著低于其他組（分別為91.20%±0.46%，85.11%±0.52%，79.43% ±0.33%）（P＜0.05）。發(fā)酵乳中乳酸菌的活菌數(shù)在貨架期內(nèi)必須保持一定數(shù)量，本研究中LB-ND02與STND03接種比例為1∶100發(fā)酵乳中，LB-ND02和STND03的存活率最高，有應(yīng)用于實際生產(chǎn)中良好潛力。本研究中LB-ND02與ST-ND03接種比例為1∶1發(fā)酵乳中B.lactisV9的存活率很低，這是由于發(fā)酵時間較短，B.lactisV9沒有得到充分生長，加上后酸化影響，故其存活率最低。而其他接種比例組中B.lactisV9的存活率并沒有隨其后酸化減弱而增高，可見后酸化并不是造成B.lactisV9死亡的主要原因。如前所述，可能是發(fā)酵乳中過氧化氫累積造成B.lactisV9的死亡，但是本研究中沒有對發(fā)酵乳中過氧化氫質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定，是否由此導(dǎo)致B.lactisV9活菌數(shù)下降，有待進(jìn)一步研究。雖然LB-ND02與ST-ND03接種比例為1∶10發(fā)酵乳中B.lactisV9存活率最高，但由于發(fā)酵時間較短，發(fā)酵結(jié)束活菌數(shù)較低（見表2），實際生產(chǎn)中受到局限。LB-ND02與ST-ND03接種比例為1∶1000和1∶100發(fā)酵乳中B.lactisV9存活率在80%左右，且發(fā)酵結(jié)束其活菌數(shù)增加5-10倍（見表2），綜合發(fā)酵所用時間考慮，LB-ND02與ST-ND03接種比例為1∶100時，更適于實際生產(chǎn)應(yīng)用。

4 結(jié)論

本研究通過對發(fā)酵乳的酸度、黏度、脫水收縮性、FAN及活菌數(shù)的測定，評價LB-ND02和ST-ND03的接種比例對B.lactisV9益生菌發(fā)酵乳品質(zhì)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，LB-ND02和ST-ND03的接種比例，顯著影響發(fā)酵乳的發(fā)酵時間、B.lactisV9活菌數(shù)、后酸化及黏度。當(dāng)降低LB-ND02接種量時，可提高B.lactisV9的活菌數(shù)，減輕發(fā)酵乳后酸化現(xiàn)象。綜合結(jié)果分析，當(dāng)LBND02與ST-ND03接種比例為1∶100時，發(fā)酵乳發(fā)酵時間適宜、發(fā)酵結(jié)束B.lactisV9活菌數(shù)較高，貯藏期間后酸化較輕、B.lactisV9存活率較高，可應(yīng)用于實際生產(chǎn)。

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Effects of inoculum ratios of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus and Streptococcus thermophilus on the quality of probiotic fermented milk by Bifidobacterium lactis

LI Hui,BAI Mei,WANG Ji-cheng,WEI Ai-bin,KONG Ya-nan,ZHANG He-ping,SUN Tian-song
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineer,Education Ministry of China,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China)

Different ratios(1∶1,1∶10,1∶100,1∶1000)ofLactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusND02(LB-ND02)andStreptococcus thermophilusND03(ST-ND03)plus withBifidobacterium lactisV9(B.lactisV9,2.0×107g-1)were used as starter cultures for milk fermentation.Some indexs of prepared probiotic fermented milk were determined for evaluation for effect of different ratios of inoculum on the quality of probiotic fermented milk during the fermentation and storage.The results showed the fermentation time was significantly prolonged,viable numbers ofB. lactisV9 was significantly increased.After the fermentation followed by a 28 d storage,the survival ofB.lactisV9 were significantly different and the postacidifition was weakened as the ratio of LB-ND02 decreased..It is suggested that different ratios of LB-ND02 and ST-ND03 significantly influence the fermentation time,viable numbers ofB.lactisV9,postacidifition and visicosity during the fermentation and storage.

Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusND02;Streptococcus thermophilusND03;Bifidobacterium lactisV9;Quality of probiotic fermented milk

TS252.54，Q93-33

A

1001-2230（2012）03-0007-04

2011-11-07

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（NO.2011AA100901，2011AA100902）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目資助（No.nycytx-0501）；內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金（2010Zd17）。

李慧(1987-)，女，碩士研究生，從事乳制品科學(xué)方面的研究。

孫天松