對中國以人巨細胞病毒感染小鼠模型進行相關研究的質(zhì)疑和剖析

舒賽男 劉興樓 Ming Zhang 董永綏

人巨細胞病毒(HCMV)也稱皰疹病毒5型，屬皰疹病毒β亞科，為線狀雙鏈DNA病毒。HCMV感染是人類最常見的感染性疾病，幾乎任何年齡的個體均可患病。在發(fā)達國家和發(fā)展中國家人群的感染率為40%～100%。中國是HCMV感染的高發(fā)區(qū)，上海人群CMV IgG陽性率1～3歲組為60.37%，>20歲組為97.03%[1]。HCMV感染呈慢性終身性感染。在免疫正常人群，HCMV感染主要表現(xiàn)為病毒潛伏(latency)，伴不時有無癥狀的病毒復活(reactivation)；HCMV又是機會感染原，在免疫低下(胎兒、嬰幼兒)或免疫缺陷人群(艾滋病及器官移植患者等)可產(chǎn)生疾病，如先天感染可致小頭畸形、智力障礙和神經(jīng)性耳聾等多種損害；嬰兒感染易累及肝臟；器官移植及艾滋病患者則可導致移植失敗、HCMV肝炎、肺炎、腦炎或全身播散性感染，甚至死亡[2]。近年來研究又發(fā)現(xiàn)，HCMV感染還可能與動脈粥樣硬化斑塊形成[3]、冠心病球囊血管成形術后的再狹窄[4]以及多種惡性腫瘤(如膠質(zhì)母細胞瘤、髓母細胞瘤、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌和唾液腺腫瘤)的發(fā)生有關[5]。因此，對HCMV的研究一直是各國科學界的熱點問題。

由于HCMV感染具有嚴格的物種特異性，因此，難以建立HCMV感染的動物模型從而在整體水平上研究HCMV致病機制及其防治。于是，各種動物CMV，包括小鼠CMV(MCMV)、大鼠CMV(RCMV)、豚鼠CMV(GPCMV)和猿猴CMV(RhCMV)感染各自宿主的研究被廣泛應用。各種動物CMV感染模型因其特點不同而應用于不同的研究中，RCMV感染模型主要用于CMV相關血管疾病的研究[6]；因GPCMV可以通過胎盤，GPCMV感染的豚鼠模型多用于CMV先天感染的研究[7, 8]；RhCMV感染模型雖因代價高、動物獲取困難很少采用，但卻更接近人類HCMV感染，可用于疫苗研制、抗病毒藥物研發(fā)、免疫及衰老等領域的研究[9]；MCMV感染模型因動物的易得性、易操作性和相關檢測試劑的豐富性，其應用最為廣泛，Balb/c小鼠對MCMV天然易感，被最常采用，國外學者新近利用一些特殊處理小鼠研究HCMV感染取得進展，如聯(lián)合免疫缺陷小鼠用于HCMV視網(wǎng)膜炎的研究[10]、轉基因小鼠用于HCMV先天感染的研究[11]或人化小鼠用于HCMV潛伏和活化的研究[12]，其中人化小鼠被認為是最具潛力的研究HCMV感染的模型工具，但仍存在人化小鼠操作困難以及不同實驗室缺乏統(tǒng)一標準的問題。

目前國際上仍公認無法建立HCMV感染野生型動物的模型，也沒有一種動物模型能完美模擬人類的HCMV感染[13, 14]。然而近年來，中國學者先后有13篇[15～28]文章報道建立了HCMV感染野生型小鼠模型(表1)。文章全部采用HCMV AD169株接種Balb/c或昆明小鼠，分別“成功”建立了HCMV感染小鼠腦組織、HCMV感染小鼠椎間盤組織、HCMV感染致小鼠間質(zhì)性肺炎、HCMV先天性感染致小鼠肝臟損傷、HCMV先天性感染再激活致小鼠腸炎等模型。

本文在仔細閱讀和分析上述13篇文章基礎上，認為這些文章中的實驗方法和結果對“HCMV感染可突破物種屏障”一說并未提供足夠的理論和實驗依據(jù)。

首先，欲證明某種病原體成功感染某種機體，應該達到微生物學證病律——柯赫法則(Koch's postulates)的要求[29]：①在模型動物中出現(xiàn)相同的微生物，且在健康動物體內(nèi)不存在；②從模型動物分離出病原，并能在培養(yǎng)基中得到純培養(yǎng)或者以全基因組序列分析證實為該病原；③用這種病原的純培養(yǎng)接種健康而敏感的寄主，同樣的疾病會重復發(fā)生；④從試驗發(fā)病的宿主中能再次分離培養(yǎng)出該病原。

由于HCMV尤其是HCMV AD169株，在分子水平和MCMV有高度相似性[30]，因此，所有HCMV感染小鼠的研究應該在造模前先排除MCMV的感染，如對實驗小鼠，在研究前先進行MCMV IgM及IgG測定，以排除MCMV感染[31, 32]。因為MCMV很容易在小鼠中傳播，據(jù)澳大利亞研究報道[33]，自由放養(yǎng)家鼠MCMV感染率可高達100%，其中不同病毒株的混合感染最高達66.7%，平均混合感染率為34.2%，免疫正常的實驗鼠也很易感染，而且同樣可以感染多個不同毒株。HCMV AD169株和MCMV分子水平的相似性表現(xiàn)在它們有相同的基因組大小(230 kb)、相近的G+C含量(約59%)和多達78個相同的開放讀碼框(部分見表2)[30]，因此對動物模型中HCMV分子水平的證實，即便發(fā)現(xiàn)某種CMV DNA、mRNA片段的陽性，很有可能是潛在MCMV感染引起的假陽性，應該進行HCMV AD169株全基因組測序證實，并排除MCMV感染。

表1 HCMV感染小鼠模型的文獻概括

表2 HCMV(AD169株)與MCMV(Smith株)相同的開放讀碼框

注：所列為代表性部分，詳細請見參考文獻[30]

病毒的分離培養(yǎng)一直被作為病毒學檢測的金標準，但是早在1972年就有文獻報道，MCMV可以引起人雙倍體細胞株(WI-38)出現(xiàn)典型的細胞病變(CPE)，但受感染的人雙倍體細胞并不產(chǎn)生具有感染性的子代病毒，為流產(chǎn)性感染[34]。因此，不能單純依靠觀察到CPE就證實HCMV分離成功，CPE有可能是小鼠體內(nèi)原有的MCMV感染所致，亦有可能遇到MCMV變異使之確實可以在人細胞中復制[35]。目前已有試驗證實MCMV不感染人細胞，并不是病毒不能進入細胞，而是病毒進入細胞后啟動了細胞凋亡，導致MCMV無法在人細胞內(nèi)進行完整病毒的DNA復制和基因表達[36]。此外，針對HCMV的血清學檢測同樣存在與MCMV抗體交叉反應的可能，其中臨床使用最廣泛的HCMV pp65抗原的片段就被證實可以誘導小鼠產(chǎn)生自身抗體，出現(xiàn)抗原抗體反應陽性[37]。

其次，證明HCMV感染野生型小鼠造模成功應該采用可靠的檢測方法和證實手段。表1所列文章采用了不同的檢測方法，可將其分為5類：①觀察組織病理學變化；②病毒分離，主要是觀察人成纖維細胞出現(xiàn)CPE；③HCMV某個基因片段擴增陽性；④血清學檢測HCMV抗原抗體；⑤電鏡觀察病毒顆粒等。文獻[16]僅觀察了組織病理學變化，沒有進行病原的相關檢測，證據(jù)不足；文獻[17～20,22～24,27,28]進行了“病毒分離”，但文獻中的“病毒分離”均限于觀察到特征性的CPE，CPE的產(chǎn)生有可能由組織中游離的母代HCMV所致，也有可能是潛在的MCMV感染所致，應該采用可靠的方法證實病毒培養(yǎng)與分離中確實產(chǎn)生了HCMV AD169的感染性病毒顆粒；文獻[17～24,26～28]進行了HCMV基因片段的檢測，大部分為PCR或原位雜交檢測DNA，若除外MCMV潛在感染所致的假陽性，DNA檢測陽性也只能說明局部有病毒核酸片段，并不能代表造模成功；其中文獻[23,24]檢測了病毒mRNA(分別是HCMV UL83，片段長度766 bp，HCMV UL54，片段長度142 bp)，同樣不能排除MCMV或母代HCMV的可能，可靠的證據(jù)應該是從小鼠模型的樣本中得到病毒全基因組測序與己知的HCMV AD169(GenBank accession number X17403，AC146999)比對相符才行[38, 39]；文獻[21～25]進行了抗原或抗體的檢測，但均沒有排除與MCMV抗體交叉反應的可能；文獻[20,22]用電鏡觀察到了病毒顆粒，只能說明局部有病毒，同樣存在MCMV或母代HCMV可能，并不能表示HCMV突破物種屏障感染小鼠成功。

綜上所述，證實HCMV突破物種屏障成功感染小鼠應該是從小鼠模型的樣本中得到HCMV純培養(yǎng)成功或者HCMV的全基因組序列，并且培養(yǎng)所得的HCMV可以復制出同樣的模型，2次模型中還能分離培養(yǎng)出HCMV。

HCMV確實感染野生型動物成功？該感染確實為活動性感染？該動物模型的疾病表現(xiàn)確實由HCMV感染引致？問題答案需要謹慎對待。不能僅僅依靠一句“成功建立”來敷衍解釋，HCMV突破物種屏障感染野生型動物一說還需要更縝密細致的設計和更全面深入的研究來證實。

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