液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用分析紫杉醇和多西他賽中流動相體系的優(yōu)化

錢 雋 郁韻秋

（1復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室 上海 201203；2復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院化療科 上海 200032）

液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（LC－MS或LC－MS／MS）技術(shù)是基于色譜的高分離能力及質(zhì)譜的高靈敏度和專屬性的分離檢測技術(shù)，已經(jīng)成為生物、制藥領(lǐng)域的必備分析手段之一。在用電噴霧離子化（electrospray ionization，ESI）質(zhì)譜進(jìn)行分析時，液相色譜流動相的組成已證明是影響化合物離子化的重要因素。其中，流動相中添加劑的化學(xué)性質(zhì)、濃度以及添加劑控制的溶液pH值對分析物的響應(yīng)值都有明顯影響［1－2］。

紫杉醇（paclitaxel）和多西他賽（docetaxel）是臨床上常用的紫杉烷類抗癌藥物。兩者具有相似的理化性質(zhì)，極性都較弱，在ESI源中不易形成帶電荷離子。LC－MS／MS技術(shù)用于分析紫杉醇和多西他賽的靈敏度較差，在分析方法開發(fā)時必須在流動相中使用添加劑來提高質(zhì)譜響應(yīng)［3－4］。如紫杉醇，盡管文獻(xiàn)中都采用ESI源正離子模式，但就流動相的水相組分而言，有選擇0．1%甲酸［5－7］、0．1%乙酸［8］、10mmol／L 甲 酸 銨［9］、2mmol／L 乙 酸 銨［10］等。由于各實(shí)驗(yàn)室儀器型號和配件的不同以及分析方法開發(fā)過程的技術(shù)差異，各實(shí)驗(yàn)室在建立紫杉醇的分析方法時仍需進(jìn)行流動相條件的優(yōu)化。

質(zhì)譜儀的進(jìn)樣方式包括直接進(jìn)樣和色譜進(jìn)樣。前者是指樣品通過針泵而不經(jīng)色譜分離，直接進(jìn)入離子源電離后進(jìn)行質(zhì)譜分析。對于絕大多數(shù)質(zhì)譜儀器而言，從待測物離子產(chǎn)生到獲得離子的響應(yīng)信號僅僅需要毫秒級的時間。但大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室在建立及優(yōu)化液相條件的過程中往往采用色譜進(jìn)樣，即樣品在合適的流動相條件下經(jīng)色譜柱分離后，由色譜流出液導(dǎo)入質(zhì)譜。每次流動相條件的改變，意味著對流動相的更換及脫氣、色譜柱的平衡及沖洗等步驟，此過程需要數(shù)小時的時間。本實(shí)驗(yàn)分別通過這兩種進(jìn)樣方式，研究紫杉醇和多西他賽在含不同添加劑的溶液或流動相中的離子化規(guī)律，探索簡化流動相優(yōu)化過程的可行方法。在此基礎(chǔ)上，建立了人血漿中紫杉醇的LC－MS／MS分析方法并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證及應(yīng)用于臨床樣品測定。

材料和方法

儀器Shimadzu LC－20AD液相色譜系統(tǒng)包括二元梯度泵、真空在線脫氣機(jī)、柱溫箱和自動進(jìn)樣器（日本島津公司）；API 3200Qtrap三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司），配置TurbolonSpray離子源、HARVARD pumpⅡ針泵及安裝 Analyst 1．5軟件的微處理機(jī)。

試劑紫杉醇對照品（純度99．9%）和多西他賽標(biāo)準(zhǔn)品（純度98．8%）均購于中國藥品生物制品檢定所；甲醇、叔丁基甲醚、甲酸、乙酸、甲酸銨和乙酸銨均為色譜純（德國 Merck KGaA公司，64271 Darmstadt）；純水由法國Millipore超純水儀制備。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制精密稱取紫杉醇和多西他賽各10mg，分別用甲醇溶解，配成各自濃度為400 μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

于純水－甲醇（30∶70，v／v）溶劑中加入適量紫杉醇和多西他賽的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成紫杉醇和多西他賽濃度均為20μg／mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，供針泵直接注射進(jìn)樣。同樣，分別以含不同添加劑，如0．1%甲酸、0．1%乙酸、多種濃度乙酸銨、甲酸銨（濃度分別為0．05、0．2、1、5、20mmol／L）、1mmol／L 甲酸銨（pH 3．0、4．0、6．5、7．5）等的水溶液替代前述方法中的純水，與甲醇以3∶7的比例混合（按此比例配制，以使樣品中水－甲醇的配比與LC－MS／MS方式下流動相的配比相似）。按照上述方法配制成紫杉醇和多西他賽濃度均為20μg／mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液－A，即得到含各種添加劑的直接注射進(jìn)樣溶液。

取適量紫杉醇和多西他賽的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別用50%的甲醇－水溶液稀釋，配制成紫杉醇和多西他賽濃度均為40ng／mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液－B，供LC－MS／MS分析。

針泵直接進(jìn)樣的電噴霧質(zhì)譜（ESI－MS／MS）分析將濃度為20μg／mL的紫杉醇和多西他賽混合溶液－A，通過針泵以10μL／min的流速導(dǎo)入ESI源。通過全掃描確定化合物母離子，以多反應(yīng)離子監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）選擇相對豐度較高且信號穩(wěn)定的離子對。對去簇電壓（declustering potential，DP）、碰撞能量（collision energy，CE）、碰撞室入口電壓（colliosion cell entrance potential，CEP）、碰撞室出口電壓（colliosion cell exit potential，CXP）等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。確定最佳質(zhì)譜參數(shù)為：ESI源，正離子模式；噴霧電壓5 500V；離子源溫度550℃；霧化氣壓力20 psi；輔助氣壓力60psi（1psi＝6．895kPa，下同）；氣簾氣壓力10psi。MRM監(jiān)測離子對、去簇電壓及碰撞電壓等見表1。通過針泵注入紫杉醇、多西他賽與各種添加劑的混合溶液，考察待測物在ESI源正離子模式下的響應(yīng)情況。

表1 紫杉醇和多西他賽的質(zhì)譜優(yōu)化條件Tab 1 The optimaized MS／MS conditions for paclitaxel and docetaxel

LC－MS／MS分析濃度為40ng／mL的紫杉醇和多西他賽混合溶液－B，經(jīng)液相系統(tǒng)的自動進(jìn)樣器導(dǎo)入。液相分離條件為：Shimadzu Shim－pack XRODS色譜柱（3．0mm×75mm，2．2μm，日本島津公司），柱溫為40℃；流動相組成為甲醇－水體系（73∶27，v／v），流速為0．4mL／min，進(jìn)樣體積為10μL。質(zhì)譜分析條件采用優(yōu)化后的質(zhì)譜條件。通過LCMS／MS系統(tǒng)考察流動相中加入不同添加劑后待測物的質(zhì)譜響應(yīng)。

分析人血漿中紫杉醇的LC－MS／MS方法學(xué)驗(yàn)證及實(shí)際樣品測定（以多西他賽作內(nèi)標(biāo)）在健康人群的空白血漿樣品中加入紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品，配成標(biāo)示濃度分別為0．5、1．0、2．5、10、50、200、500ng／mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線血樣，并配制低、中、高濃度分別為1、25和400ng／mL的血漿質(zhì)控樣品。方法學(xué)的主要指標(biāo)包括：特異性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量下限、準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)、樣品穩(wěn)定性和提取回收率。建立的分析方法應(yīng)用于臨床受試者的藥代動力學(xué)研究。

血漿樣品處理過程如下：吸取50μL血漿樣品，加入10μL內(nèi)標(biāo)溶液（多西他賽，濃度為1μg／mL），混勻，加入1mL叔丁基甲醚，渦旋提取3min。于4℃條件下14 000r／min離心10min后，吸取上清液并用氮?dú)獯党軇?，殘?jiān)?00μL液相色譜流動相溶解，14 000r／min離心10min后，取上清液進(jìn)樣10μL分析。若臨床樣品中的紫杉醇濃度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍上限，用健康人空白血漿對其進(jìn)行稀釋并混勻。取50μL稀釋后血樣，按以上步驟再進(jìn)行血樣前處理以供分析。

結(jié) 果

添加劑種類的影響紫杉醇和多西他賽的分子結(jié)構(gòu)中缺乏氨基或羧基等易電離的基團(tuán)（圖1），所以由針泵注入的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液中未加入添加劑時，在ESI源中的質(zhì)譜響應(yīng)相對弱，離子化效率低，表明此時不易形成帶電荷離子。圖2所示為不同添加劑條件下紫杉醇的離子信號強(qiáng)度，是由質(zhì)譜直接進(jìn)樣的MRM信號圖。當(dāng)含揮發(fā)性溶質(zhì)如0．1%甲酸、0．1%乙酸、1mmol／L甲酸銨或1mmol／L乙酸銨組成的溶液直接注入質(zhì)譜后，紫杉醇的離子強(qiáng)度明顯提高，其中以1mmol／L甲酸銨的響應(yīng)強(qiáng)度最大。這是由于加入的溶質(zhì)促使離子在溶液中預(yù)形成，有利于提高待測化合物的離子化效率。按照其作用強(qiáng)弱依次排序，1mmol／L甲酸銨優(yōu)于0．1%乙酸、1mmol／L乙酸銨和0．1%甲酸。不同添加劑組成的溶液對多西他賽的離子化作用與紫杉醇相似，說明溶質(zhì)的存在對于此類化合物的離子化程度有重要的影響。比較各種添加劑對待測化合物的離子化效應(yīng)?？梢奓C－MS／MS進(jìn)樣與由針泵進(jìn)樣的響應(yīng)變化趨勢相似，均以1mmol／L甲酸銨溶液的作用最強(qiáng)，優(yōu)于同濃度的乙酸銨。

圖1 紫杉醇和多西他賽的結(jié)構(gòu)示意圖Fig 1 Chemical structures of paclitaxel and docetaxel

圖2 不同添加劑組成溶液由質(zhì)譜直接進(jìn)樣的紫杉醇離子強(qiáng)度Fig 2 Signal intensity of paclitaxel ion in solutions with different additives by direct sampling to mass spectrometry

通 過 LC－MS／MS 系 統(tǒng) 進(jìn) 樣，在 Shimadzu Shim－pack XR－ODS色譜柱上，實(shí)驗(yàn)考察了同樣配比（甲醇－水相為73∶27，v／v）、不同水相組成（甲醇－水溶液、甲醇－0．1%甲酸水溶液、甲醇－0．1%乙酸水溶液、甲醇－1mmol／L甲酸銨水溶液、甲醇－1mmol／L乙酸銨水溶液）的流動相體系中紫杉醇和多西他賽的質(zhì)譜響應(yīng)。不同流動相條件下紫杉醇的LCMS／MS色譜圖（圖3）顯示，當(dāng)流動相為甲醇－水時，化合物的色譜峰響應(yīng)很弱；而在水相中分別加入不同的揮發(fā)性溶質(zhì)后，紫杉醇的響應(yīng)強(qiáng)度顯著增加，說明上述添加劑有利于紫杉醇的離子化，其中甲醇－1 mmol／L甲酸銨水溶液為流動相時的紫杉醇色譜峰響應(yīng)最大，表明此條件下紫杉醇的離子化效率最高，檢測靈敏度最高。各種流動相組成溶液對多西他賽的離子化作用與紫杉醇相似。

甲酸銨濃度的影響紫杉醇和多西他賽的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液中分別加入5種不同濃度的甲酸銨：0．05、0．2、1、5和20mmol／L，由針泵注入，比較其質(zhì)譜響應(yīng)。結(jié)果顯示，甲酸銨濃度為0．05mmol／L時的質(zhì)譜響應(yīng)較低，隨著添加劑濃度的增加，響應(yīng)逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度為1mmol／L時，待測化合物的離子強(qiáng)度達(dá)到最大。之后隨著濃度繼續(xù)增加，響應(yīng)反而降低，至20mmol／L時響應(yīng)明顯減弱。

通過LC－MS／MS系統(tǒng)進(jìn)樣，考察甲醇與5種不同濃度甲酸銨水溶液（0．05、0．2、1、5和20mmol／L）組成的流動相體系對紫杉醇和多西他賽色譜峰響應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，隨著添加劑濃度的增加，響應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)，在1mmol／L時色譜峰響應(yīng)達(dá)到最大；但是甲酸銨濃度進(jìn)一步增加后，紫杉醇和多西他賽的響應(yīng)反而降低。說明溶液中的離子強(qiáng)度對紫杉醇和多西他賽的離子化效率有明顯影響，當(dāng)甲酸銨達(dá)到一定濃度時，［M＋H］＋更易于生成，離子化效率提高；然而濃度過高時，由于電荷密度增加引起的排斥力使得噴霧中心的離子密度降低，待測化合物的離子形成相應(yīng)減少［1，11］，離子化效率因而降低。將兩種不同進(jìn)樣方式、不同濃度甲酸銨對紫杉醇和多西他賽的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度作圖（圖5），便于對離子化效應(yīng)作直觀比較。

pH 的影響在pH 值分別為3．0、4．0、6．5、7．5的1mmol／L甲酸銨溶液中，無論是針泵進(jìn)樣還是連接色譜柱液相進(jìn)樣，紫杉醇和多西他賽均以

圖4 不同種類添加劑對紫杉醇和多西他賽離子強(qiáng)度的影響Fig 4 Comparison of the signal intensity of paclitaxel and docetaxel based on different sorts of additives

圖3 不同添加劑組成的流動相條件下紫杉醇的LC－MS／MS色譜圖Fig 3 LC－MS／MS chromatograms of paclitaxel by mobile phases with different additives

將兩種不同進(jìn)樣方式、不同種類添加劑對紫杉醇和多西他賽的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度作圖（圖4），可直觀1mmol／L甲酸銨水溶液（pH＝6．5）的響應(yīng)強(qiáng)度最大（圖6）。紫杉醇和多西他賽均為弱堿性化合物，pKa值相近，分別為11．99和12．02，所以當(dāng)溶液pH小于10時，化合物已充分解離，并電離為［M＋H］＋的形式，其離子化效率達(dá)到較高程度，檢測靈敏度也因此提高。但是，當(dāng)溶液的pH值繼續(xù)降低時，化合物的解離度并沒有進(jìn)一步增加，反而由于酸濃度過高時易形成離子對［12］，降低了離子化效率。

圖5 不同濃度的甲酸銨溶液對紫杉醇和多西他賽質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度的影響Fig 5 Comparison of the signal intensity of paclitaxel and docetaxel based on the ammonium formate solutions with different concentrations

分析方法學(xué)評價(jià)在上述研究的基礎(chǔ)上，建立了人血漿中紫杉醇的LC－MS／MS分析方法（以多西他賽作內(nèi)標(biāo)）并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，進(jìn)而用于臨床樣品測定。色譜檢測結(jié)果顯示，在服藥前的空白血樣中未測到紫杉醇和內(nèi)標(biāo)（圖7A），提示內(nèi)源性物質(zhì)對分析無明顯干擾；在加入標(biāo)準(zhǔn)品紫杉醇和內(nèi)標(biāo)的樣品中（圖7B）及患者給予紫杉醇注射液175mg／m24h后的血漿色譜圖（圖7C）結(jié)果顯示，紫杉醇與內(nèi)標(biāo)物的保留時間分別為2．9和3．3min，峰形良好。方法學(xué)研究表明，本方法測定紫杉醇的線性范圍為0．5～500ng／mL，定量下限為0．5ng／mL，低、中、高濃度質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度為99．5% ～104．0%，日內(nèi)精密度為3．5%～4．4%，日間精密度為0．80%～2．80%，樣品的提取回收率高于85%，無明顯基質(zhì)效應(yīng)。此分析方法以靈敏、準(zhǔn)確、快速、可靠的特點(diǎn)滿足了生物樣品測定的要求。

圖6 不同pH的甲酸銨溶液對紫杉醇和多西他賽質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度的影響Fig 6 Comparison of the signal intensity of paclitaxel and docetaxel based on the ammonium formate solutions with different pH

圖7 人血漿樣品中紫杉醇和內(nèi)標(biāo)（多西他賽）的LC－MS／MS色譜圖Fig 7 Chromatogram of paclitaxel and docetaxel in human plasma by MRM scan mode A：Blank plasma；B：Blank plasma with paclitaxel and docetaxel；C：A plasma sample from a patient at 4 h after administration of paclitaxel injection．

討 論

紫杉醇和多西他賽的極性較弱，在ESI源中不易形成帶電荷離子。然而通過在液相溶劑體系中添加促電離物質(zhì)后，可促使待測化合物達(dá)到較高的離子化效率，從而有效提高檢測靈敏度和改善重現(xiàn)性。此外，流動相中添加劑的種類、濃度以及pH值，都影響著紫杉醇和多西他賽在ESI的離子化過程。在含不同添加劑的溶劑中，待測物的離子化效率有顯著差異。通過質(zhì)譜的直接進(jìn)樣和LC－MS／MS進(jìn)樣對溶液或流動相中添加劑的促離子化作用進(jìn)行考察，確認(rèn)兩種方式所呈現(xiàn)的質(zhì)譜響應(yīng)的變化趨勢一致。因此，最終確定以對待測化合物響應(yīng)最佳的1mmol／L甲酸銨溶液（pH＝6．5）作為流動相中的水相組成。

液相色譜流動相中的添加劑不僅明顯影響待測化合物在ESI的響應(yīng)，而且影響其在色譜上的保留時間和峰形。紫杉醇和多西他賽的極性較小，在反相色譜上保留時間和峰形穩(wěn)定。經(jīng)試驗(yàn)，當(dāng)流動相中有機(jī)相和水相比例固定時，向水相中加入不同的添加劑如純水（H2O）、0．1%甲酸、0．1%乙酸、不同濃度與不同pH的甲酸銨和乙酸銨后，比較色譜圖發(fā)現(xiàn)，紫杉醇保留時間差異小于0．03min，多西他賽的保留時間差異小于0．06min，各色譜峰的拖尾因子均在0．95至1．05之間，說明這兩種化合物的色譜保留時間和峰形并不隨流動相的離子強(qiáng)度和pH值的不同而發(fā)生變化。認(rèn)為此類色譜保留不易受溶質(zhì)影響的化合物，尤其適合采用質(zhì)譜直接進(jìn)樣方式對流動相中的水相組份作篩選。相反，若是極性大的化合物，因其色譜保留時間和峰形易受流動相中溶質(zhì)的影響，通過質(zhì)譜直接進(jìn)樣方式優(yōu)化的流動相組成應(yīng)用于LC－MS／MS分析時情況較為復(fù)雜，需要進(jìn)一步研究。

本文通過質(zhì)譜的兩種進(jìn)樣方式－直接進(jìn)樣和色譜進(jìn)樣，研究紫杉醇和多西他賽在含不同添加劑的溶液或流動相中的離子化規(guī)律，兩種方式對溶液中添加劑種類、濃度及pH等條件作出篩選的結(jié)果一致。說明在建立紫杉醇或多西他賽的LC－MS／MS定量方法時，采用質(zhì)譜直接進(jìn)樣方式對流動相中的水相組成進(jìn)行優(yōu)化的方法是切實(shí)可行的。與常用的LC－MS／MS進(jìn)樣方法相比，質(zhì)譜直接進(jìn)樣的方式只需將待測化合物配制成各種溶液后直接針泵進(jìn)樣，優(yōu)化流動相條件時無需反復(fù)脫氣和平衡色譜柱，方法高效、便捷；而且溶劑用量只需數(shù)毫升，節(jié)約了成百倍的溶劑，更為經(jīng)濟(jì)環(huán)保，是紫杉烷類化合物的LC－MS／MS分析方法建立過程中極為有效和可靠的流動相優(yōu)化方法。ionization process in liquid chromatography－mass spectrometry［J］．JChromatogrA，2009，1216（4）：685－699．

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