固相萃取－氣相色譜聯(lián)用測定海洋沉積物中的長鏈烯酮

白亞之，鄒建軍，劉季花，高晶晶，施美娟，崔菁菁

（1.國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島266061；2.海洋沉積與環(huán)境地質(zhì)國家海洋局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266061）

固相萃取－氣相色譜聯(lián)用測定海洋沉積物中的長鏈烯酮

白亞之1，2，鄒建軍1，2，劉季花1，2，高晶晶1，2，施美娟1，2，崔菁菁1，2

（1.國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島266061；2.海洋沉積與環(huán)境地質(zhì)國家海洋局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266061）

建立了測定痕量長鏈烯酮的分析方法，獲得了優(yōu)化的前處理?xiàng)l件、氣相色譜檢測條件。對定性定量方法及實(shí)驗(yàn)條件必須滿足的要求進(jìn)行了評價(jià)。通過過程質(zhì)量控制（Quality Control，QC）對整個方法進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，本研究所建立的分析方法能夠滿足沉積物樣品長鏈烯酮測定的要求：儀器的檢測限分別為25.75ng／g和28.54ng／g；方法的檢測限分別為86ng／g和95ng／g；平均回收率介于67%～89%，回收率相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為9.33%和9.39%；精密度 RSD（C37∶3）＝14.07%，RSD（C37∶2）＝13.17%。利用此方法對部分樣品進(jìn)行了分析，測得的結(jié)果與布萊梅大學(xué)實(shí)驗(yàn)室所測的一致。

固相萃?。粴庀嗌V；長鏈烯酮；海洋沉積物

在古海洋研究中，表層海水溫度是反映海洋熱容量及古氣候、古環(huán)境演化的一個最重要的參數(shù)［1］。獲得該參數(shù)的主要手段可以分成兩大類：無機(jī)地球化學(xué)［1］（如浮游有孔蟲δ18O、浮游有孔蟲Mg／Ca比值）和有機(jī)地球化學(xué)（如長鏈烯酮不飽和度（UK37）［2－3］和 TEX86［4－5］）。相對于其它替代指標(biāo)，長鏈烯酮不飽和度在鈣質(zhì)生物殼體不易保存的海域具有明顯的優(yōu)勢。

長鏈烯酮不飽和度通常指含有37個碳原子的長鏈烯酮的不飽和度［3］，用UK37或UK｀37來表示，公式如下：

式中，U為不飽和；K代表酮；C37∶x為具有37個C原子的長鏈不飽和酮中含有x個C＝C鍵，由于C37∶4Me的含量一般很低，一般把公式簡化為［6］

海洋沉積物中長鏈烯酮主要由E.huxley分泌［7］，現(xiàn)代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，其生長環(huán)境與海水溫度存在顯著的對應(yīng)關(guān)系［8］，且不受鹽度、碳酸鹽溶解作用及長鏈烯酮豐度等因素的影響。前人的對比結(jié)果表明，基于長鏈烯酮不飽和度所獲結(jié)果與其它古溫度替代指標(biāo)結(jié)果具有顯著的正相關(guān)關(guān)系［6－9］，并在海洋和湖泊的古氣候、古環(huán)境研究中得到廣泛應(yīng)用。

國內(nèi)外學(xué)者對長鏈烯酮的生態(tài)條件［10－11］、應(yīng)用范圍［12－15］進(jìn)行了大量的報(bào)道。但是在分析測試環(huán)節(jié)，不同的實(shí)驗(yàn)室采用不同的前處理方法和參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析［16－18］。為此，依據(jù)自身的實(shí)驗(yàn)室條件，摸索并建立一條可靠的分析測試方法對于開展相關(guān)古海洋學(xué)及古氣候研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 標(biāo) 樣

本實(shí)驗(yàn)共采用4個標(biāo)樣，記為標(biāo)樣1，標(biāo)樣2，標(biāo)樣3和標(biāo)樣4。它們依次為2－Nonadecanone，Squalane，n－Octatriacontane，n－Tetracontane，均適用于EPA方法。標(biāo)樣1用來作內(nèi)標(biāo)，標(biāo)樣2用作測定烯酮的保留時(shí)間標(biāo)記物，標(biāo)樣3和4用作保留時(shí)間標(biāo)記物及含量的計(jì)算。標(biāo)樣1和3購自Chem Service公司，標(biāo)樣2和4購自Sigma－Aldrich Chemie Gmbh公司。

表1 標(biāo)樣的信息Table 1 The information of samples

精確稱取4種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.05mg，用四氯化碳定容至50mL，質(zhì)量濃度分別為1 000μg／L。分別量取4種單標(biāo)5mL至另一50mL容量瓶中配制成質(zhì)量濃度為100μg／L混標(biāo)。內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為100μg／L。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

二氯甲烷、正己烷、甲醇均為色譜純（Merck公司，德國）；無水硫酸鈉（經(jīng)450℃灼燒4h）；超純水（Milli－Q純水機(jī)）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)器材

玻璃器皿、石英離心管等在使用前經(jīng)過450℃灼燒4h

冷凍干燥機(jī)；超聲破碎儀；離心機(jī)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；氮吹濃縮儀；Angilent氣相色譜儀（GC 7890A）。

1.2 樣品處理

1.2.1 樣品前處理

樣品冷凍干燥后，碎樣成200目。取樣品0.2g加入50mL石英離心管中，加50μL混合內(nèi)標(biāo)，加DCM溶劑25mL超聲破碎提取3次，每次5min。每次提取的樣品經(jīng)離心（3 000r／min，8min）后上清液轉(zhuǎn)移至250mL燒瓶中。

1.2.2 凈化方法

本方法采用初級凈化和二級凈化方式分析樣品。

所謂“哲理”并不是“形而上”的高深理論，它很多時(shí)候其實(shí)就是作者的“有感而發(fā)”，是外物與作者內(nèi)心的契合，“人不如丘”的映襯手法就自然而然地讓“游記”具有了理性的光輝！

初級凈化：將提取的樣品在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋至約0.5mL。樣品用DCM溶解轉(zhuǎn)移至2mL樣品瓶后，氮吹儀吹干，加入300μL KOH甲醇溶液，在80℃的條件下保持2h。加500μL正己烷振蕩，收集上清液，重復(fù)4次。

二級凈化：將收集的上清液使用氮吹儀濃縮至0.5mL，使用硅膠層析小柱對樣品凈化處理，多于10mL正己烷預(yù)淋洗后，加入樣品。分別用多于10mL的正己烷、多于10mL正己烷／DCM＝1／2（體積比）、多于10mL甲醇淋洗，分別收集三部分淋洗液。氮吹，DCM轉(zhuǎn)移至內(nèi)插管，定容到25μL。目標(biāo)物在第二部分的淋洗液中，GC測定。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

安捷倫GC－7890A氣相色譜儀；DB－5毛細(xì)管色譜柱，J＆W 122－1062規(guī)格60m×250μm×0.25μm；進(jìn)樣口溫度為280℃；FID檢測器溫度為320℃；程序升溫：初始溫度70℃，以20℃／min的速率升到300℃，保持52min；載氣為高純氮，流速1.5mL／min；分流進(jìn)樣：分流比10∶1，進(jìn)樣量為3μL。

1.3.2 保留時(shí)間定性

由于烯酮沒有標(biāo)準(zhǔn)樣品，n－C38烷烴和n－C40烷烴用來做保留時(shí)間的標(biāo)記物。C37和C38的化合物群組在這兩個標(biāo)記物之間出峰。

1.3.3 定量計(jì)算公式

本方法采用內(nèi)標(biāo)法定量，使用C19酮做內(nèi)標(biāo)物，用一系列不同濃度的混合標(biāo)樣分別進(jìn)樣，可得標(biāo)準(zhǔn)校正曲線（圖1）。利用n－C38烷烴和n－C40烷烴的相對響應(yīng)因子進(jìn)行含量的計(jì)算［1，18－19］，n－C38烷烴的響應(yīng)因子用來計(jì)算C37群組的含量，n－C40烷烴的響應(yīng)因子用來計(jì)算C38群組的含量，在本實(shí)驗(yàn)中只計(jì)算C37的兩種不飽和烯酮。按照方法1.2提取一個樣品進(jìn)樣，記錄色譜圖，根據(jù)含內(nèi)標(biāo)物的待測組分溶液色譜響應(yīng)值，采用以下公式計(jì)算C37目標(biāo)化合物的含量（ci）：

式中，Ai和As分別為樣品和內(nèi)標(biāo)物的峰面積；cs為加入內(nèi)標(biāo)物的量；f為相對響應(yīng)因子，f計(jì)算公式為：

圖1 C38和C40的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線Fig.1 The standard calibration curve of C38and C40

1.4 質(zhì)量控制

1.4.1 檢測限和加標(biāo)回收率的測定

儀器的檢測限：實(shí)驗(yàn)空白和樣品同時(shí)進(jìn)行測試，取石英管一只，加入50μL標(biāo)樣，測定儀器檢測限。提取凈化方法同1.2。

方法的檢測限：由于烯酮沒有標(biāo)樣，所以用C38來做方法的檢測限，使用質(zhì)量濃度為1ng／μL的C38標(biāo)準(zhǔn)溶液來進(jìn)行分析，進(jìn)樣量為3μL。

C19酮用來做回收率指示劑，分別準(zhǔn)備12個樣品，其中6個樣品加50μL內(nèi)標(biāo)，6個樣品加125μL內(nèi)標(biāo)，提取和凈化方法同1.2。所得樣品進(jìn)行GC測定。

1.4.2 精密度的測定

本研究使用采自日本海KCES1巖芯的樣品進(jìn)行精密度的測定。稱取同一樣品7份各0.2g，分別加入內(nèi)標(biāo)50μL。提取凈化方法同1.2。

1.5 日本海KCES1巖芯不同層位樣品的測定

選取日本海 KCES1巖芯不同層位的6個樣品進(jìn)行測試：KCES1－36，KCES1－40，KCES1－66，KCES1－112，KCES1－138，KCES1－140分別進(jìn)行測定，每個樣品做3次平行測定。提取凈化方法同1.2.1和1.2.2。

2 結(jié)果與討論

2.1 保留時(shí)間

提取日本海KCES1巖芯樣品，凈化方法同1.2.2，所得的樣品進(jìn)安捷倫GC－7890A色譜儀進(jìn)行分析，獲得色譜圖（圖2）及各個化合物保留時(shí)間（表2）。

圖2 樣品色譜分析譜圖Fig.2 Gas chromatogram of long－chain alkenones in sample

表2 各個化合物的保留時(shí)間Table 2 The retention time of compound

2.2 檢測限

檢測限通常分為儀器的檢測限和方法的檢測限。儀器的檢測限具體做法是把標(biāo)準(zhǔn)校正曲線的最小點(diǎn)濃度稀釋到最好是能檢測到的最小分析信號所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物濃度，連續(xù)進(jìn)樣7次或者更多，算出標(biāo)準(zhǔn)偏差作為Sb帶入公式儀器的檢測限

即為儀器的檢出限，Sx為分析校正曲線的斜率。本方法根據(jù)對樣品空白的測定確定噪聲，通過公式（3）計(jì)算出最小濃度，算出標(biāo)準(zhǔn)偏差，代入公式（5）可得儀器的檢測限。方法的檢測限按照公式（6）計(jì)算：

式中，LOD為方法的檢測限；Nd為基線噪音；c為C38的濃度；H為C38的色譜峰面積；V為進(jìn)樣體積。兩種烯酮的儀器檢測限和方法檢測限見表3。

表3 測定空白7次的峰面積及檢測限Table 3 The peak areas and limits of measurement of blanks

2.3.1 加標(biāo)樣品回收率測定結(jié)果

加標(biāo)樣品6次測定的結(jié)果以及平均值見表4。目標(biāo)化合物的平均回收率為67%～89%，回收率相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.33%～9.39%。

表4 C19酮加標(biāo)回收的測定結(jié)果Table 4 The results of recovery test with adding standard sediment sample of C19ketone

2.3.2 精密度測定結(jié)果

本方法的精密度以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示，7次測定樣品的測定結(jié)果見表5。對方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求，一般主要取決于被測對象的含量，含量越高要求相對標(biāo)準(zhǔn)偏差越低，例如，＞10%的含量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差一般≤1%，隨著含量的降低，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差可逐步增加，增至5%，10%，20%，30%甚至50%。計(jì)算本方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 RSD（C37∶3）＝14.07%，RSD（C37∶2）＝13.17%。

表5 目標(biāo)物C37∶3和C37∶2的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 5 The RSD of C37∶3and C37∶2

2.4 沉積物樣品測定結(jié)果

隨機(jī)選取日本海KCES1巖芯不同層位的6個樣品，分別進(jìn)行測定，所得的結(jié)果見表6，并且與德國布萊梅大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室測試結(jié)果進(jìn)行比較，得到一致的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)室的分析方法同樣也是用硅膠層析小柱和氣相色譜聯(lián)用來測定的長鏈烯酮。完全證明該方法可以用于沉積物中長鏈烯酮的分析，完全滿足本實(shí)驗(yàn)室測定的要求。

表6 同一樣品不同實(shí)驗(yàn)室的測定結(jié)果Table 6 Results of the same sample in different labs

3 結(jié) 語

本研究將固相萃取技術(shù)和氣相色譜分析方法協(xié)同應(yīng)用于海洋沉積物中長鏈烯酮成分的測試工作。整個分析獲得了優(yōu)化的前處理?xiàng)l件和氣相色譜條件。分析過程的質(zhì)量控制顯示，本方法具有很好的準(zhǔn)確性和精密性，能夠滿足海洋沉積物樣品長鏈烯酮的測定要求。

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Determination of Long－chain Alkenones in Marine Sediments Using SPE－GC Method

BAI Ya－zhi1，2，ZOU Jian－jun1，2，LIU Ji－h(huán)ua1，2，GAO Jing－jing1，2，SHI Mei－juan1，2，CUI Jing－jing1，2
（1.First Institute of Oceanography，SOA，Qingdao 266061，China；2.Key Laboratory of State Oceanic Administration for Marine Sedimentology and Environmental Geology，SOA，Qingdao 266061，China）

The study aim is to build a method of determining long－chain alkenones in marine sediments，and to gain the optimum condition of preparation of samples，and the best condition of Gas Chromatography（GC）and to assess，the requirement of quality，quantity and experimental condition.According to the validation of the quality control（QC），the results proved that the analytical method satisfied the requirements of the determination of long－chain alkenones in marine sediments.The instrument limits of detection were LOD（C37：3）＝25.75ng／g，LOD（C37：2）＝28.54ng／g；the method limits of detection were LOD（C37：3）＝86ng／g，LOD（C37：2）＝95ng／g.and the recoveries were between 67%～89%，of which the relative standard deviations were 9.33%，9.39%.RSD（C37：3）＝14.07%，RSD（C37：2）＝13.17%.Based on the determination method，several samples were analyzed and have the same results which analyzed in different lab.

solid phase extraction；gas chtomatography；long－chain alkenones；marine sediments

April 29，2011

O657.7

A

1671－6647（2012）04－0541－07

2011－04－29

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目——末次冰期以來鄂霍次克海古生產(chǎn)力變化得生物標(biāo)志物記錄及其對氣候變化的響應(yīng)（40906035）；國家海洋局青年海洋科學(xué)基金項(xiàng)目——我國近海沉積物有機(jī)碳氮國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制（2011314）；國家海洋局第一海洋研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)——20萬年以來鄂霍次克海古生產(chǎn)力演化及其古氣候意義（GY02－2010G24）

白亞之（1983－ ），女，山西晉中人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事有機(jī)地化分析方面研究.E－mail：baiyazhi＠fio.org.cn

（王 燕 編輯）