金雀異黃素抑制大鼠膀胱腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究

李晶磊，何朝宏，許長寶

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科 450014)

膀胱腫瘤是中國發(fā)病率最高的泌尿系腫瘤，有逐年增多的趨勢[1]。金雀異黃素是來源于豆類植物異黃酮類化合物,是大豆異黃酮的主要活性成分。近年來研究表明金雀異黃素具有抑癌及防癌作用，對乳腺癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌等多種腫瘤細(xì)胞株都具有抑制作用[2-5]，但對膀胱腫瘤的作用研究較少，本實(shí)驗(yàn)通過研究金雀異黃素對N-甲基亞硝基脲(MNU)誘導(dǎo)的SD大鼠膀胱腫瘤的抑制作用，以期為膀胱腫瘤的治療提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級飼養(yǎng)的7～8周SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量100～160 g,由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(許可證號:2010B070)。飼養(yǎng)條件:YX型實(shí)驗(yàn)動物潔凈柜飼養(yǎng),常規(guī)濕度(40%～50%),溫度(22±2)℃。

1.2試劑 MNU購于美國Sigma公司，以pH 6.0的枸櫞酸緩沖液為溶劑,配成濃度為20 mg/mL的誘導(dǎo)液,―20 ℃儲存?zhèn)溆?。金雀異黃素純度大于或等于98%，相對分子質(zhì)量為270.2，分子式C15H10O5，為白色粉末狀，購于陜西慧科生物股份有限公司(批號：KHT2088766)。將金雀異黃素溶于75%乙醇，濃度為10 mg/mL儲存液，使用生理鹽鹽水稀釋，乙醇最終濃度應(yīng)低于0.75%。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 按雌雄平分的原則隨機(jī)分成3組，對照組、實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組，各20只。按照劉紅耀等[6]利用MNU誘導(dǎo)制備大鼠膀胱腫瘤的方法，在各組大鼠膀胱內(nèi)注入0.1 mL MNU誘導(dǎo)液(20 mg/mL)，每2周1次,共灌注5次。同時實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組的大鼠經(jīng)腹腔內(nèi)注射金雀異黃素，劑量分別是：實(shí)驗(yàn)1組0.5 mg/kg,實(shí)驗(yàn)2組1.0 mg/kg，每2日1次，連續(xù)給藥10周；對照組用同樣的方式注射生理鹽水。15周時，乙醚麻醉處死動物,完整切取膀胱,切開膀胱，觀察黏膜形態(tài),記錄腫瘤數(shù)目,用游標(biāo)卡尺測量腫瘤直徑，精密秤稱質(zhì)量，石蠟包埋,切片HE染色病理分析。

1.4觀察指標(biāo) 每日觀察并記錄大鼠的飲食及活動一般情況，給藥前稱體質(zhì)量并記錄。經(jīng)腹腔給藥時因操作失誤，實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組各死亡1只大鼠，在實(shí)驗(yàn)過程中，死亡的大鼠，不在統(tǒng)計(jì)之列。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，剝?nèi)∧[瘤組織稱腫瘤質(zhì)量，按以下公式計(jì)算各組抑瘤率(IR)：IR=(對照組腫瘤質(zhì)量―實(shí)驗(yàn)組腫瘤質(zhì)量)/對照組腫瘤質(zhì)量×100%

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 11.5軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1實(shí)驗(yàn)前、后大鼠體質(zhì)量變化情況 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前、后體質(zhì)量減少情況見表1。

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前、后體質(zhì)量減少情況

a:P<0.05，與對照組比較。

表2 各組大鼠膀胱成瘤情況

a:P<0.05，與對照組比較。

2.2各組大鼠膀胱成瘤情況 對照組有19只大鼠膀胱有腫瘤形成(成瘤率95.00%)，主要表現(xiàn)為結(jié)節(jié)形、菜花狀，多為數(shù)個結(jié)節(jié)，并伴有出血潰瘍。實(shí)驗(yàn)1組有8只大鼠膀胱有腫瘤形成(成瘤率68.00%)，表現(xiàn)為結(jié)節(jié)狀，無潰瘍形成；而未形成腫瘤的6只大鼠膀胱黏膜表現(xiàn)出空虛狀、增厚、粗糙。實(shí)驗(yàn)2組有12只大鼠膀胱有腫瘤形成(成瘤率63.00%),腫瘤均為小結(jié)節(jié)狀；而未形成腫瘤的7只大鼠膀胱膜黏色澤鮮艷、粉紅、內(nèi)壁粗糙、輕度增厚。見表2。

2.3各組大鼠膀胱所形成腫瘤體積、質(zhì)量和抑瘤率比較 實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組在腫瘤體積和質(zhì)量上和對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)1組在腫瘤體積和質(zhì)量上與實(shí)驗(yàn)2組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠膀胱所形成腫瘤體積、質(zhì)量和抑瘤率比較

-：表示此項(xiàng)無數(shù)據(jù)；a:P<0.05，與對照組比較；b:P<0.05，與實(shí)驗(yàn)1組比較。

2 討 論

本實(shí)驗(yàn)利用的MNU誘導(dǎo)的60只SD大鼠膀胱腫瘤方法是目前研究膀胱腫瘤比較常用和標(biāo)準(zhǔn)的方法，具有意外死亡率低、感染率低、誘癌時間短、病理類型中的移行細(xì)胞癌比例較高及更接近于人類的膀胱腫瘤等特點(diǎn)[7]。膀胱腫瘤是泌尿系統(tǒng)中最常見的腫瘤，腫瘤細(xì)胞侵襲力很強(qiáng)，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，研究可用于預(yù)防、診治膀胱腫瘤的方法，具有重要的臨床價值和科研意義[8]。

金雀異黃素是酪氨酸激酶抑制劑的一種，酪氨酸激酶抑制劑作為一大類抗腫瘤藥物,在基礎(chǔ)和臨床研究中越來越受到人們的重視[9-10]。金雀異黃素抑制了膀胱組織生長因子的受體酪氨酸激酶,特別是抑制表皮生長因子受體(EGF-R)和血小板衍生的生長因子受體(PDGF-R)酪氨酸激酶的活性,卻很少影響絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的活性,能競爭性地抑制ATP結(jié)合到酪氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域,從而特異地抑制酪氨酸激酶的活性[11-13],這一性質(zhì)會減少生長因子對非正常細(xì)胞刺激而避免過度增生，從而使腫瘤組織在體積上和質(zhì)量上減輕。本實(shí)驗(yàn)中可以看出，金雀異黃素抑制MNU誘導(dǎo)的大鼠膀胱腫瘤的作用較明顯，主要表現(xiàn)在金雀異黃素能夠延緩患瘤大鼠體質(zhì)量的下降，使腫瘤的體積、質(zhì)量、數(shù)量減少，也能使腫瘤的成瘤率下降。雖然不同劑量金雀異黃素之間在抑制腫瘤的數(shù)量、體積等方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但是在病理分級中，劑量大的金雀異黃素組能明顯降低成瘤率,劑量越大，抑癌作用越強(qiáng)。

在膀胱腫瘤的血管形成過程中金雀異黃素能夠減少血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasmIn ogen activator，uPA)[14-15]，抑制膀胱腫瘤發(fā)展過程中微血管的形成，降低膀胱腫瘤血管密度(MVD)，從而減緩腫瘤的發(fā)展。

[1]黃玉華，嚴(yán)春寅，溫端改，等.膀胱癌合并上尿路上皮癌的診斷與外科治療[J].山東醫(yī)藥，2009，49(22)：13-14.

[2]Wei H,Bowen R,Cai Q,et al.Antioxidant and antipromotional effects of the soybean isoflavone genistein[J].Proc Soc Exp Biol Med,1995,208(1):124-130.

[3]Osalla S,Terashima Y,Kimura G,et al.Antitumour effects of the angiogenesis inhibitorAGM-1470 on rat urinary bladder tumors in-duced by N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine[J].Br J Urol Int,1999,83(5):123-128.

[4]Ji S,Willis GM,Frank GR,et al.Soybean isoflavones,genistein and genistin,inhibit rat myoblast proliferation,fusion and myotube protein synthesis[J].J Nutr,1999,129(7):1291-1297.

[5]Bei H,Bowen R,Cai Q,et al.Antioxidant and antipromotional effectsof the soybean is of lavone genistein[J].Proc Soc Exp Biol Med,1995,208(1):124-130.

[6]劉紅耀，李曉東，米振國，等.N-甲基亞硝基脲的制備及其誘導(dǎo)膀胱腫瘤的作用[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2000，17(6)：548-549.

[7]錢立新，劉訓(xùn)良，丁鴻，等.N-甲基亞硝基脲誘導(dǎo)大鼠膀胱腫瘤作用的動態(tài)觀察[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2004，21(5)：563-564.

[8]黃世明，倪江雯，魏學(xué)武，等.膀胱癌的診斷與治療[J].山東醫(yī)藥，2009，49(22)：111-112.

[9]Davis JN,Kucuk O,Sarkar FH.Genistein inhibits NF-kappa B activation in prostate Cancer cells[J].Nutr Cancer,1999,35(2):167-174.

[10]Thomadaki H,Scorilas A.BCL2 family of apoptosis-related genes:functions and clinical implications in Cancer[J].Crit Rev Clin Lab Sci,2006,43(1):1-67.

[11]金永生，劉超美.金雀異黃素的藥理作用[J].國外醫(yī)藥:植物藥分冊，2002，17(5)：190-193.

[12]鈄理強(qiáng)，張智清，郭應(yīng)祿.抗腫瘤血管再生的臨床應(yīng)用前景[J].中華外科雜志，1998，36(12)：727.

Wang Y,Raffoul JJ,Che M,et al.Prostate Cancer treatment is enhanced by genistein in vitro and in vivo in a syngeneic orthotopic tumor model[J].Radiat Res,2006,166(1 Pt 1):73-80.

[14]Oki T,Sowa Y,Hirose T,et al.Genistein induces Gadd45 gene and G2/M cell cycle arrest in the DU145 human prostate Cancer cell line[J].FEBS Lett,2004,577(1/2):55-59.

[15]Zhao JH,Arao Y,Sun SJ,et al.Oral administration of soy-derived genistin suppresses lipopolysaccharide-induced acute liver inflammation but does not induce thymic atrophy in the rat[J].Life Sci,2006,78(8):812-819.