非小細(xì)胞肺癌中半乳凝素 1的表達(dá)及其臨床意義*

薛春竹，凌 翔△，雷瓊瓊

(1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科,南昌 330006;2.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院護(hù)理系,南昌 330006)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌總數(shù)的70%～85%，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)已屬晚期[1]。尋找有效的生物標(biāo)志物和基因治療靶點(diǎn)，對NSCLC患者的早期診斷和有效治療十分重要。據(jù)相關(guān)國內(nèi)外研究報(bào)道半乳凝素1(galectin-1，Gal-1)在多種腫瘤中過表達(dá)[2]，并參與細(xì)胞的生長、黏附和增殖、凋亡和炎癥等多種生物學(xué)過程，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移和腫瘤的血管生成中起重要的作用[3]。本研究采用RT-RCR、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)研究NSCLC中的Gal-1 mRNA及蛋白表達(dá)情況，分析Gal-1表達(dá)與NSCLC的TMN分期、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1一般資料 隨機(jī)選取35例2009年1月至2010年7月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)摘除的NSCLC患者的標(biāo)本組織。男22例，女13例；平均年齡(55.20±9.1) 歲；其中鱗癌19例，腺癌16例。采用美國聯(lián)合癌癥分類委員會(AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(FIGO)2002年制定的分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期8例，Ⅱ期11例，Ⅲ期13例，Ⅳ期3例；高、中分化14例，低分化21例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例。手術(shù)治療時取癌組織、癌旁組織以及遠(yuǎn)處的正常肺組織(距癌組織邊緣大于5 cm)，所有組織標(biāo)本液氮冷凍保存待用。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 TRIzol、瓊脂糖、RT-PCR試劑盒、1 500 bp DNA Marker均購于北京天根生化科技有限公司,Gal-1和β-actin引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成,MG96G-PCR儀為Long gene產(chǎn)品,電泳儀系統(tǒng)為上海天能產(chǎn)品,Js-680B全自動凝膠成像分析儀為上海培清科技有限公司產(chǎn)品,蛋白質(zhì)電泳儀為北京六一公司產(chǎn)品，Gal-1一抗購至Santa Cruz公司，二抗均購自中杉金橋生物有限公司。

1.3方法

1.3.1RT-PCR 按TRIzol說明書對NSCLC患者癌組織、癌旁組織和及遠(yuǎn)處的正常肺組織分別提取總RNA,以上述所得總RNA為模板，應(yīng)用RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以此為模板用人Gal-1特異性引物對cDNA進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增(詳細(xì)操作步驟參見說明書)，反應(yīng)條件為 94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性20 s，53 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。采用β-actin作內(nèi)參，半定量RT-PCR方法對獲得RT-PCR參物通過瓊脂糖凝膠電泳分離檢測。Gal-1引物由Primer 6.0設(shè)計(jì)，NCBI Blast驗(yàn)證，得到引物見表1。

表1 Gal-1和β-actin引物序列

1.3.2蛋白質(zhì)印跡 定量取100 mg 組織，液氮研磨打破細(xì)胞，按每10 mg組織加入100 μL RIPA裂解液。取蛋白樣品20 μL，加入5×上樣緩沖液5 μL(體積比4∶1)，煮沸5 min后上樣。經(jīng)SDS-PAGE電泳,濃縮膠40 V,40 min;分離膠60 V,60 min。而后轉(zhuǎn)膜，放于4℃冰箱中,恒流300 mA，2 h,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜。置于含5%脫脂奶粉20 mL的TBST液中，室溫?fù)u床封閉1 h，將Gal-1一抗用TBST按1∶300濃度稀釋至3 mL，β-actin一抗用TBST按1∶500的濃度稀釋至5 mL,4 ℃孵育過夜，次日用TBST液洗膜3次，每次10 min。羊抗兔二抗(1∶3 000)37℃孵育1 h。TBS液洗膜3次，每次10 min。使用DAB試劑盒顯色。采用凝膠成像系統(tǒng)拍照，應(yīng)用其自帶Gel Pro-Analyzer 3.1軟件進(jìn)行密度定量分析。

1.3.3成像與計(jì)算 經(jīng)全自動凝膠成像系統(tǒng)拍照，SensiAnsys軟件分析Gal-1和β-actin擴(kuò)增條帶的光密度值(IOD),表達(dá)水平= Gal-1條帶的灰度值/β-actin的灰度值×100%，表達(dá)率=陽性例數(shù)/總數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1RT-PCR結(jié)果 總RNA電泳結(jié)果見圖1，各種組織RT-PCR電泳結(jié)果見圖2。NSCLC患者癌組織和癌旁組織，以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者正常肺組織中Gal-1 mRNA的表達(dá)水平均明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者正常肺組織(P<0.05)，見表2。

圖1 總RNA電泳結(jié)果

M：Marker；泳道1：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者正常肺組織；泳道2、4、8:無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者正常肺組織；泳道3、6： NSCLC患者癌旁組織；泳道5、7： NSCLC患者癌組織。

圖2各種組織Gal-1 mRNA表達(dá)電泳結(jié)果

表2 各種組織Gal-1 mRNA的相對表達(dá)水平

2.2蛋白質(zhì)印跡結(jié)果 NSCLC患者癌組織和癌旁組織，以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者正常肺組織中Gal-1蛋白表達(dá)水平明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者正常肺組織(P<0.05)，與PCR結(jié)果基本一致，見圖3。

泳道1：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者正常肺組織；泳道2:NSCLC患者癌組織；泳道3：NSCLC患者癌旁組織；泳道4 、5、6:無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者正常肺組織 。

圖3各種組織Gal-1蛋白電泳結(jié)果

2.3NSCLC患者癌組織中Gal-1 mRNA的表達(dá)與患者的性別、年齡、病理組織類型、TNM分期及分化程度的相關(guān)性 NSCLC患者癌組織中Gal-1 mRNA的表達(dá)與患者TNM分期及分化程度密切相關(guān)(P<0.05)，而與患者的性別、年齡、病理組織類型無明顯相關(guān)性(P>0.05) ，見表3。

表3 Gal-1mRNA的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

3 討 論

Gal-1為典型的細(xì)胞質(zhì)蛋白，其相對分子質(zhì)量為14.5×103，定位在22q13.1上的單基因編碼，常以同源二聚體的形式存在，其結(jié)構(gòu)上包含有一段長約135個氨基酸的糖類識別區(qū)(carbohydrate-recognition domains,CRD)和對β-半乳糖苷具有特殊親和力的區(qū)域，根據(jù)其分子的結(jié)構(gòu)分為原型、嵌合型及串聯(lián)重復(fù)性三類，因能與β-半乳糖苷特異性非共價(jià)結(jié)合并參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、增殖、遷移能力等，可能參與了腫瘤病程的演進(jìn)。據(jù)國內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道Gal-1與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切有關(guān)[4]。Paz等[5]發(fā)現(xiàn)Gal-1通過與癌基因H-Ras相互作用，為其提供膜錨定位點(diǎn)，增強(qiáng)Ras介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,從而促進(jìn)細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，Gal-1還可導(dǎo)致RAF-1和ERK的持續(xù)活化并激活轉(zhuǎn)錄因子,促使細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化。Rubinstein等[6]通過反義核酸技術(shù)靶向性抑制腫瘤細(xì)胞中Gal-1的表達(dá)后發(fā)現(xiàn),封閉Gal-1基因會增強(qiáng)T細(xì)胞調(diào)節(jié)的抗腫瘤作用,也同樣顯示了Gal-1在促進(jìn)腫瘤免疫逃逸中的作用。Gal-1還與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度密切相關(guān)，與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力有一定的關(guān)系[7]。Jung等[8]的研究中提示，乳腺癌組織中Gal-1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中明顯高表達(dá)。Den等[9]的研究顯示，重組的Gal-1可劑量依賴性地增加腫瘤細(xì)胞對層連蛋白-1(laminin-1)或纖連蛋白(fibronectin)的黏附。另有實(shí)驗(yàn)顯示Gal-1能增加前列腺癌和卵巢癌細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，Gal-1可通過MAC-2BP蛋白調(diào)節(jié)同型的人黑色素瘤細(xì)胞的聚集。Gal-1還能通過與整合素分子結(jié)合或調(diào)節(jié)整合素分子的表達(dá)來調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移過程，腫瘤細(xì)胞通過分泌Gal-1削弱T細(xì)胞應(yīng)答,使腫瘤細(xì)胞獲得傾向于免疫抑制的生長環(huán)境，進(jìn)而參與到腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。另外，Gal-1可通過促進(jìn)腫瘤血管新生而影響腫瘤細(xì)胞的生長。在Gal-1缺陷的小鼠中，由于血管新生受到抑制,腫瘤的生長也受到明顯抑制，Gal-1在腫瘤血管生長中起到基礎(chǔ)性作用[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)Gal-1表達(dá)的改變與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及獲得轉(zhuǎn)移表型密切相關(guān)，可作為一個潛在的NSCLC發(fā)病與轉(zhuǎn)移的觀察指標(biāo)。Gal-1是一種分布廣泛、作用復(fù)雜、調(diào)節(jié)精細(xì)的半乳糖結(jié)合蛋白，其參與腫瘤細(xì)胞凋亡、黏附的確切機(jī)制尚不清楚，深化其結(jié)構(gòu)分析、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控方面的研究，將為腫瘤、炎癥和自身性免疫疾病的診治提供新的策略。

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