合成生物學(xué)在微生物傳感器中的應(yīng)用

施冬艷，何珣，陳怡露

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京 210009)

生物傳感器［1］起源于20世紀(jì)中期，1962年Clark等［2］提出了把酶與電極結(jié)合來測定酶底物的設(shè)想，1967年Updike和 Hicks［3］研制出世界上第一支葡萄糖氧化酶電極，標(biāo)志著生物傳感器的誕生。生物傳感器是一種精密的分析器件，它結(jié)合了一種生物或生物衍生敏感部件(如組織、微生物細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞受體、酶、抗體、核酸等)與一只理化換能器(如電化學(xué)電極、光學(xué)檢測部件、氣敏電極、熱敏電阻等)，能夠產(chǎn)生間斷或連續(xù)的數(shù)字電信號，信號強(qiáng)度與被分析物含量成正比，從而對被分析物進(jìn)行定量和定性的測定。根據(jù)生物敏感部件的不同，可以把生物傳感器分類為組織傳感器［4］、微生物傳感器［5-6］、細(xì)胞器傳感器［7］、免疫傳感器［8］、酶傳感器［9-10］、DNA 傳感器［11］，其中酶傳感器和微生物傳感器研究得最多，應(yīng)用也最為廣泛。

微生物傳感器因為其成本低、操作簡便、設(shè)備簡單的特點而成為近年來生物傳感器領(lǐng)域研究的熱點，主要應(yīng)用于生物工業(yè)［12-13］、環(huán)境監(jiān)測［5］以及臨床醫(yī)學(xué)［14-15］等領(lǐng)域。謝佳胤等［16］曾指出，生物傳感器商品化要具備以下條件:足夠的敏感性和準(zhǔn)確性、易操作、價格便宜、易于批量生產(chǎn)、生產(chǎn)過程中進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測。表1比較了各種生物傳感器選擇性、穩(wěn)定性等多項性能。

由表1可以看出，微生物傳感器最大的優(yōu)點是成本低、操作簡便、設(shè)備簡單，相比其他生物傳感器具有獨特的可取之處，因此其市場前景十分巨大和誘人。

表1 各種生物傳感器的性能對比Tab 1 The properties of all kinds of biosensor

作者擬通過分析目前微生物傳感器的研究手段和遇到的問題，探討合成生物學(xué)這一新興交叉學(xué)科在研究微生物傳感器中的應(yīng)用，并通過對應(yīng)用實例的分析闡述其研究思路和發(fā)展前景。

1 微生物傳感器

1.1 概念及原理

微生物傳感器［17］是生物傳感器的一個重要分支，它使用微生物活細(xì)胞或細(xì)胞碎片作為敏感材料，利用其體內(nèi)的各種酶系及代謝系統(tǒng)來測定和識別被分析物，原理見圖1。

如圖1所示，微生物傳感器的一般原理大致可以分為3種情況:(1)樣品中的物質(zhì)會誘導(dǎo)啟動微生物細(xì)胞中特定的啟動子，進(jìn)而使得報告基因轉(zhuǎn)錄、翻譯成可被檢測的報告蛋白;(2)微生物與底物作用，在同化樣品中有機(jī)物的同時，微生物細(xì)胞的呼吸活性有所提高，反應(yīng)中會消耗氧或生成二氧化碳，兩者都是可檢測物質(zhì);(3)微生物與底物作用后生成各種可檢測到的電極敏感代謝產(chǎn)物。在微生物數(shù)量和活性保持不變的情況下，它消耗的溶解氧量或所產(chǎn)生的電活性物質(zhì)、二氧化碳、報告蛋白的量反映了被檢測物質(zhì)的量，再借助氣體敏感膜電極(如溶解氧電極、氨電極、二氧化碳電極等)或離子選擇電極(如pH玻璃電極等)以及微生物燃料電池檢測出溶解氧和二氧化碳、電活性物質(zhì)、報告蛋白的變化，便能得出待測物質(zhì)的量。

圖1 微生物傳感器工作原理示意圖Fig 1 Principle of microbial sensor

1.2 微生物傳感器研究面臨的困難

微生物具有價格低廉、無需考慮輔助因素、微生物成分可再生等優(yōu)點，尤其適用于發(fā)酵控制和需群酶順序作用的反應(yīng)。但是目前微生物傳感器的制備仍然存在許多困難與不足之處，限制了它的進(jìn)一步市場化［18］。如:(1)由于微生物細(xì)胞中含有多種酶，可同時對多種底物響應(yīng)而產(chǎn)生干擾，使得微生物傳感器的選擇性不盡如人意，響應(yīng)時間比酶傳感器要長［19］;(2)用于環(huán)境監(jiān)測時測定對象中的毒害因素如重金屬和有毒有機(jī)物是影響微生物壽命的關(guān)鍵因素［20］，也是微生物傳感器市場化的主要控制因素，但是目前篩選天然抗性菌株的工作量很大，且具有盲目性和局限性;(3)環(huán)境中污染物的數(shù)量越來越多，而目前構(gòu)建的報告菌株的廣譜性還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠;(4)由于微生物細(xì)胞保，輸方式也有待改進(jìn)。

為了解決上述問題，使微生物傳感器能得到更好的應(yīng)用和推廣，需要更具創(chuàng)新性的理念和技術(shù)，特別是交叉學(xué)科的研究。合成生物學(xué)，這一曾被《Nature》雜志譽(yù)為是“將生物領(lǐng)域基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化為實際社會生產(chǎn)力，連接基礎(chǔ)學(xué)科與實際應(yīng)用學(xué)科的高科技領(lǐng)域”［21］，是近年來生物技術(shù)領(lǐng)域備受矚目的新興學(xué)科。合成生物學(xué)正是以設(shè)計合成人工基因組并制造出具有指定功能可自我繁殖的活細(xì)胞，完成或優(yōu)化自然細(xì)胞所不能完成的任務(wù)為目標(biāo)，有望為微生物傳感器目前遇到的局限和困難提供創(chuàng)新性的解決辦法［22-23］。

2 合成生物學(xué)

2.1 簡介

2009《 · 》 “Focus on Synthetic Biology”的合成生物學(xué)專輯［24］，包括社論、進(jìn)展綜述、前景展望、產(chǎn)業(yè)發(fā)展、專利產(chǎn)權(quán)、政府監(jiān)管等16篇論文。社論指出:合成生物學(xué)通過計算機(jī)設(shè)計，用4種化學(xué)品(A、G、T和C 4種核苷酸)進(jìn)行基因合成，然后“即插即用”到具有最小化基因組的底盤生物中，可以想象我們在將來能夠毫不費力地創(chuàng)造不同形式的生命，這項突破性的技術(shù)具有改變生物工程的潛力。與基因工程把一個物種的基因延續(xù)、改變并轉(zhuǎn)移至另一物種不同，合成生物學(xué)的目的在于建立人工生物體系，讓它們像電路一樣運行。

合成生物學(xué)領(lǐng)域有3大內(nèi)容和目標(biāo):(1)有別于以往拆解生命的方式，其借由建構(gòu)生命來了解生命，合成基因組簡化的“底盤微生物”［25］;(2)將基因工程、代謝工程等所使用的部件標(biāo)準(zhǔn)化［26］，使其能與現(xiàn)有系統(tǒng)相結(jié)合，創(chuàng)造出更多功能更復(fù)雜的系統(tǒng);(3)成為跨領(lǐng)域的交叉學(xué)科，將分子生物學(xué)、基因工程、計算機(jī)領(lǐng)域的系統(tǒng)設(shè)計和系統(tǒng)控制理論、統(tǒng)計學(xué)、信息學(xué)等應(yīng)用到生物系統(tǒng)，開拓重組生物與工程的交集，產(chǎn)生真正可由程式控制的生物。

合成生物學(xué)發(fā)展的主要歷程如表2所示。

表2 合成生物學(xué)主要發(fā)展歷程Tab 2 The main development of synthetic biology

2.2 應(yīng)用前景

基因工程注重重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)包括基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計與構(gòu)建(即重組DNA技術(shù));下游技術(shù)則涉及基因工程菌或細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。

而合成生物學(xué)的目標(biāo)，則是試圖采用從自然界分割出來的標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)部件(可被修飾、重組乃至創(chuàng)造)，進(jìn)行理性(設(shè)計)的重組(乃至從頭合成)以獲得新的生命(生物體)。

目前合成生物學(xué)應(yīng)用最典型的例子就是Keasling研究小組合成青蒿素，他們對青蒿基因及其代謝途徑進(jìn)行了設(shè)計組裝與精密調(diào)控，使得大腸桿菌及酵母細(xì)胞合成青蒿酸(青蒿素前體)的能力提高了幾個數(shù)量級，大幅降低了青蒿酸的生產(chǎn)成本［29］。另外，MIT化工系Gregory研究組［32］運用合成生物學(xué)手段利用大腸桿菌合成紫杉醇，他們把紫杉醇代謝途徑分成大腸桿菌固有的異戊烯焦磷酸上游模塊和異源的萜類化合物

，水平，最終使得紫杉二烯(紫杉醇的前體物)產(chǎn)量較改造前提高了15 000倍。

合成生物學(xué)在其他領(lǐng)域也都具有不錯的應(yīng)用前景，包括新藥研發(fā)和改進(jìn)藥物［33］、生物基產(chǎn)品制造［34-35］、可再生和可持續(xù)能源的利用［36］、環(huán)境污染的生物治理以及用于環(huán)境中檢測有毒化學(xué)物質(zhì)的生物傳感器［37-38］等。

2.3 生物安全

合成生物學(xué)雖具有巨大的生命力和廣闊應(yīng)用前景，但隨著這個領(lǐng)域的發(fā)展，合成生物學(xué)的安全性問題也越來越多，包括致病感染性疾病的威脅［39］、生態(tài)平衡的破壞［40］以及倫理、法律［41］等。我們在看到合成生物學(xué)的美好前景的同時，也要認(rèn)真應(yīng)對這些潛在風(fēng)險［42］，制定并完善合成生物學(xué)法規(guī)體系與管理制度，預(yù)防惡意的行為，周到地考慮對人類、其他物種、自然界環(huán)境的影響。

2010年美國生物倫理研究委員會發(fā)表了《新方向:合成生物學(xué)和新出現(xiàn)技術(shù)的倫理》的研究報告［43］、 、可?！蹲匀弧?、《科學(xué)》等雜志，《紐約時報》等媒體，“生物工業(yè)組織”等產(chǎn)業(yè)協(xié)會也作出了積極的反應(yīng)。這些都為合成生物學(xué)的發(fā)展提供了極好的氛圍和機(jī)會。在各國相關(guān)法規(guī)約束以及各國科學(xué)家自身努力下，合成生物學(xué)一定會得到更快、更健康的發(fā)展。

2.4 合成生物學(xué)在微生物傳感器中的應(yīng)用

2.4.1 應(yīng)用思路 就合成生物學(xué)的研究內(nèi)容和目標(biāo)，我們可以看出其技術(shù)思路有望突破目前微生物傳感器研究中遇到的一些局限，為微生物傳感器的發(fā)展作出新貢獻(xiàn)［44-45］，比如說:

(1)相關(guān)領(lǐng)域的研究者們一直在尋找選用能對污染物起響應(yīng)的更加特異和有效的新調(diào)控部件［46-47］，在未來我們可以運用這些生物部件提高微生物傳感器的靈敏性。

最小基因組的研究也給微生物傳感器帶來了新的進(jìn)展，最小基因組可以減少背景噪音，提高微生物傳感器的選擇性。而提高微生物傳感器的靈敏性和選擇性都能減少響應(yīng)時間。

(2)對環(huán)境中的有毒有機(jī)物，我們可以找到相關(guān)的酶并對其進(jìn)行強(qiáng)表達(dá)，將解毒和報告結(jié)合起來，既解除環(huán)境中有毒物質(zhì)對微生物細(xì)胞的生存危害又能檢測到有毒物。

(3)為了解決保存和運輸?shù)膯栴}，我們可以嘗試選用孢子微生物，然后用孢子作為微生物傳感器的保存形式［38，48］。

(4)合成生物學(xué)的思路是將“基因”或者生物部件連接成網(wǎng)絡(luò)。我們可以嘗試將兩個報告基因這樣的部件組裝在一起形成雙報告基因，這樣可以拓寬微生物工程菌株的檢測范圍，提高傳感器的廣譜性和方便性。

2.4.2 應(yīng)用實例 目前，國際上已經(jīng)開展了應(yīng)用合成生物學(xué)開發(fā)微生物傳感器的相關(guān)研究，其中一個例子就是愛丁堡大學(xué)的Joshi研究小組設(shè)計和構(gòu)建出的一種能夠監(jiān)測水中砷含量的工程菌［38］。而在愛丁堡大學(xué)之前已有許多研究者從酶學(xué)和生物學(xué)的角度對砷檢測進(jìn)行了研究。其中一種方法是用乙酰膽堿酯酶(Ach)做成的電極來感應(yīng)砷，Sanllorente-Mendez等［49］用該法研究出可以檢測到1.1×10-8mol·L-1砷的Ach/SPCE生物傳感器，雖然這一研究很成功，但是4℃的保存條件使得這一裝置很難運輸。而Sarkar等［50］將L-半胱氨酸用聚丙烯酰胺固定在工作的電極上，以此來檢測砷濃度，砷的檢測濃度低至1～30 μg·L-1且和信號呈線性關(guān)系。但是，該裝置中昂貴的鉑電極為這一裝置的商業(yè)化帶來很大的困難［51］。而微生物傳感器為這些問題的解決提供了可能性［52］。Tani等［53］利用帶有ars啟動子和gfp的重組大腸桿菌制成了一種微生物傳感器系統(tǒng)，但該裝置需要紫外系統(tǒng)來讀出結(jié)果，限制了它的方便性。而Yoshida等［54］運用一種光合細(xì)菌Rhodopseudomonas palustris作為出發(fā)菌株，該菌在響應(yīng)砷污染物時會發(fā)生肉眼可見的顏色變化，但該結(jié)果只起到了定性的作用。上述研究雖頗有成就，但是還不能滿足一個優(yōu)良的微生物傳感器所需的條件，即成本低、簡單、保存方便、高選擇性、可在貧困地區(qū)使用等。愛丁堡大學(xué)的研究成果突破了原先的局限，為微生物傳感器的發(fā)展打開了新局面。

愛丁堡大學(xué)的Joshi利用具有感知水中砷離子功能的啟動子，設(shè)計了相應(yīng)的微生物傳感器。該啟動子在有砷離子存在的情況下能改變細(xì)胞的代謝反應(yīng)，并最終改變?nèi)芤旱膒H。利用微生物作為檢測器，不僅可以大大降低成本，且較之其他砷離子檢測器而言，利用pH的變化作為砷離子存在與否的信號很容易被pH檢測儀甚至更方便的pH試紙檢測到，使儀器的實用性得到極大的提高［38］。

該砷離子生物檢測系統(tǒng)［55］如圖2所示，整個系統(tǒng)只有在砷離子或乳糖存在時才有響應(yīng)。裝置1中的啟動子3為組成型常開啟動子，下游lacI基因表達(dá)的產(chǎn)物L(fēng)acI抑制啟動子4的啟動。

圖2 砷傳感器示意圖Fig 2 The sketch map of arsenic biosensor

(1)當(dāng)環(huán)境中只有乳糖存在而無砷離子存在時，乳糖與LacI結(jié)合，解除LacI對啟動子4的抑制，啟動子4順利啟動，其下游的尿素酶基因表達(dá)產(chǎn)生尿素酶。尿素酶催化尿素轉(zhuǎn)化為氨和二氧化碳，環(huán)境的pH升高，其值約為9～10。

(2)當(dāng)環(huán)境中的砷離子濃度較低(如5 μg·L-1)時，響應(yīng)低濃度砷離子的高敏感裝置2啟動。砷離子與ArsR結(jié)合，解除其對啟動子2的抑制，下游的λcI基因順利表達(dá)，產(chǎn)生的CI蛋白抑制裝置1的啟動子4，關(guān)閉尿素酶基因的表達(dá)，阻止其對尿素的催化作用。此時由于沒有相應(yīng)酸或堿的產(chǎn)生，系統(tǒng)的pH維持在中性狀態(tài)(由于少量殘余尿素的存在，pH可能會略高于中性)，即pH約為7。

(3)當(dāng)環(huán)境中砷離子濃度較高(如20 μg·L-1)時，響應(yīng)高濃度砷離子的裝置3啟動。砷離子與ArsD結(jié)合，解除其對啟動子1的抑制，下游的lacZ基因順利表達(dá)，lacZ基因編碼的β-半乳糖苷酶催化乳糖的發(fā)酵，使其分解為乙酸和乳糖酸，此時pH約為4.5。最終通過溴百里酚藍(lán)顯色劑顯色來顯示不同的pH。如圖3所示。該模型不但達(dá)到了半定量的水平，可區(qū)分無砷、低濃度砷、高濃度砷3種狀態(tài)，而且可以用細(xì)胞凍干粉和風(fēng)干的細(xì)胞作為保存方式，且常溫下保質(zhì)期至少為幾周，極大提高了保存和運輸?shù)姆奖阈浴?/p>

圖3 溴百里酚藍(lán)作為pH指示劑的砷分析Fig 3 Arsenic assays conducted with bromthymol blue as pH indicator

愛丁堡大學(xué)的研究成果無疑給合成生物學(xué)領(lǐng)域注入了一支強(qiáng)心劑，不僅證明了合成生物學(xué)的研究思想是可行的，還顯示出了合成生物學(xué)的獨特優(yōu)勢?，F(xiàn)在合成生物學(xué)正在發(fā)展階段，還有很多問題需要解決，但是我們相信隨著技術(shù)的不斷成熟，合成生物學(xué)定能為人類作出不可小覷的貢獻(xiàn)。

3 發(fā)展前景

微生物傳感器由于酶源豐富且穩(wěn)定、周期短成本低、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點一直是相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點，而快速發(fā)展的合成生物學(xué)手段能較好地彌補(bǔ)目前微生物傳感器的缺陷，進(jìn)一步推進(jìn)微生物傳感器的研究發(fā)展。未來必將是交叉學(xué)科發(fā)揮作用的時代，微生物傳感器和合成生物學(xué)的結(jié)合定能為這一領(lǐng)域帶來突破性的進(jìn)展，從而造福人類。

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