丹參川芎嗪注射液對(duì)TNFα干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷ET-1和ICAM-1基因表達(dá)的影響

汪 偉 呂清國(guó) (長(zhǎng)春大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 30022)

1.4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按Toyobo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行操作，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為 37℃變性15 min，95℃ 5 min。產(chǎn)物－20℃保存或立即進(jìn)行下一步PCR反應(yīng)。

1.5 實(shí)時(shí)定量熒光PCR反應(yīng) 按照Toyobo SYBR實(shí)時(shí)PCR試劑盒操作說(shuō)明，加入 4.8 μl ddH2O、10 μl SYBR、0.6 μl上游引物、0.6 μl下游引物和4 μl cDNA。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15 s;95℃ 5 s，60℃ 15s，72℃ 20 s 45 個(gè)循環(huán)。Roche 480 PCR儀上進(jìn)行定量分析。以正常對(duì)照組作為標(biāo)準(zhǔn)，其他組與其進(jìn)行比較，換算成百分率。

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種慢性炎癥性疾病，各種危險(xiǎn)因素引起細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子(TNF)和白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子作用在內(nèi)皮細(xì)胞上，內(nèi)皮素(ET)的分泌增加導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，內(nèi)皮細(xì)胞上的細(xì)胞間黏附因子(ICAM)-1表達(dá)增加，導(dǎo)致單核細(xì)胞黏附在血管內(nèi)皮細(xì)胞上，進(jìn)一步的促使AS發(fā)生和發(fā)展。活血化瘀中藥具有抗血管內(nèi)皮損傷、防治AS的作用〔1〕。采用活血化瘀法干預(yù)AS的發(fā)生發(fā)展能夠取得良好的效果〔2〕。丹參川芎嗪注射液是根據(jù)中醫(yī)活血化瘀的原理，以丹參和川芎為主的中草藥經(jīng)過(guò)現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)方法加工制成，其主要成分為丹參素和川芎嗪。臨床廣泛應(yīng)用于閉塞性腦血管疾病，如腦供血不足、腦血栓形成、腦栓塞及其他缺血性心血管疾病，如冠心病的胸悶、心絞痛、心肌梗死、缺血性腦卒中、血栓閉塞性脈管炎等的治療當(dāng)中。本文采用炎癥因子TNF-α干預(yù)致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304損傷，模擬AS時(shí)血管內(nèi)皮受損的情況，探討丹參川芎嗪注射液對(duì)與內(nèi)皮細(xì)胞功能密切相關(guān)的ET-1和ICAM-1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 丹參川芎嗪注射液由貴州拜特制藥有限公司生產(chǎn)。人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304購(gòu)于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。RPMI-1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清為 PAA公司產(chǎn)品。TNF-α為 Invitrogen公司產(chǎn)品。TRNzol總RNA提取試劑為Tiangen公司產(chǎn)品。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量熒光PCR試劑盒為Toyobo公司產(chǎn)品。引物由TAKARA公司設(shè)計(jì)和合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304的培養(yǎng)基為RPMI-1640加10%胎牛血清及1%雙抗(10 000 U/ml青霉素、10 000 μg/ml鏈霉素)，在 37℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)、傳代，以備實(shí)驗(yàn)使用。

1.3 總RNA的提取 分別收集各組細(xì)胞(正常對(duì)照組、TNF-α干預(yù)組、TNF-α+注射液組)，棄去上清，直接在培養(yǎng)板中加入1 ml TRIzol裂解細(xì)胞，反復(fù)吹打，直至無(wú)肉眼可見(jiàn)沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，室溫靜置5 min;加入0.2 ml氯仿，劇烈搖蕩15 s，室溫靜置3 min;4℃ 10 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移最上層到另一離心管中;加入500 ml異丙醇，混勻，室溫靜置20 min;4℃ 10 000 r/min離心10 min，去上清;棄去上清，加入

2結(jié)果

TNF-α導(dǎo)致ECV304細(xì)胞ET-1和ICAM-1基因表達(dá)增加，丹參川芎嗪注射液能夠抑制TNF-α所導(dǎo)致的ET-1和ICAM-基因表達(dá)的增加，隨著注射液濃度的增大，抑制程度逐漸加強(qiáng)。見(jiàn)表1。

表1 ECV304細(xì)胞中ET-1基因的表達(dá)(x ± s，%)

3討論

血管內(nèi)皮既是感知器官，同時(shí)又是效應(yīng)器官。它作為中介，在感受血流壓力變化、炎性信號(hào)及循環(huán)體系中的激素水平的同時(shí)，作出相應(yīng)的反應(yīng)，調(diào)節(jié)血管舒縮狀態(tài)，從而維持平衡。血管內(nèi)皮合成并釋放血管舒張因子〔如一氧化氮(NO)〕和收縮因子(如ET-1)，通過(guò)自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌作用調(diào)節(jié)局部和全身血管的張力。血管內(nèi)皮細(xì)胞的絕大多數(shù)功能與它能產(chǎn)生、釋放、活化多種不同作用的生物活性物質(zhì)相關(guān)〔3〕。

內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是AS疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到各種危險(xiǎn)因素如高血壓、高血脂和免疫損傷時(shí)，循環(huán)系統(tǒng)中的TNF和白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子使得內(nèi)皮細(xì)胞功能受到破壞，持續(xù)的刺激形成慢性內(nèi)皮細(xì)胞活化狀態(tài)，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的生物活性物質(zhì)數(shù)量或功能發(fā)生改變〔4〕。ICAM-1幾乎參與了單核細(xì)胞黏附和遷移轉(zhuǎn)化的全過(guò)程，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷時(shí)，刺激ICAM-1表達(dá)增加，促進(jìn)和加速了AS發(fā)生和發(fā)展〔5〕。

中醫(yī)稱AS為“脈絡(luò)痹”。血瘀證與血管內(nèi)皮損傷有著密切聯(lián)系，利用活血化瘀藥可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境及其分泌功能，從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能。活血化瘀中藥具有抗血管內(nèi)皮損傷、防治AS的作用〔1〕且取得良好的臨床效果〔2〕。

丹參可以明顯抑制AS板塊的形成，可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生成而產(chǎn)生抗AS的作用〔6〕。丹參素是丹參的主要有效成分，具有改善微循環(huán)、促進(jìn)纖維蛋白溶解、降低全血黏滯度、改善血液流變性及微循環(huán)障礙等作用〔7〕。川芎味辛性溫，功能為活血祛瘀、行氣開(kāi)郁、祛風(fēng)止痛。川芎嗪是川芎的有效成分，化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪，具有擴(kuò)張微血管、改善微循環(huán)、降低血黏度、改善血液流變學(xué)、降低毛細(xì)血管通透性、延緩AS發(fā)生發(fā)展及抗炎等作用，在防治心腦血管疾病等方面的防治中具有重要的作用〔8～10〕。

本文結(jié)果可見(jiàn)，丹參川芎嗪注射液在臨床上的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用與其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的保護(hù)作用密不可分。

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