低分子肝素制備的研究進展

嚴子琴，黃海嬋，王 暢，趙 雷，鐘衛(wèi)鴻

(浙江工業(yè)大學 生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州 310014)

低分子肝素制備的研究進展

嚴子琴，黃海嬋，王 暢，趙 雷，鐘衛(wèi)鴻

(浙江工業(yè)大學 生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州 310014)

肝素作為一種有效的抗凝藥物廣受關(guān)注，但其在使用過程中出現(xiàn)的各種副作用使人們的目光轉(zhuǎn)向了低分子肝素(LMWH)。LMWH具有更高的安全性、更好的皮下注射藥物動力學、更長的半衰期和更好的生物利用度。本文闡述了LMWH的各種制備方法，探討了LMWH制備的發(fā)展趨勢，為LMWH研究者選擇適當?shù)闹苽浞椒ㄌ峁﹨⒖肌?/p>

肝素;解聚;低分子肝素

肝素是一種異質(zhì)性多分散的硫酸化多糖，是一種抗凝血藥物，普通肝素的相對分子質(zhì)量(Mr)為3 000～30 000，平均15 000［1-3］。肝素應用于臨床時表現(xiàn)出了一些副作用，如出血并發(fā)癥、血小板減少癥等。低分子肝素(LMWH，平均Mr3 000～7 000)具有更低的副作用、更可預見的藥理作用、半衰期長和更好的生物利用度［1-2］，因而受到更多的關(guān)注。LMWH可通過部分解聚普通肝素獲得或通過控制Heparosan(肝素前體，結(jié)構(gòu)類似于未硫酸化肝素)的Mr再經(jīng)過硫酸化、乙?；揎椫频茫?-6］。

LMWH的制備方法主要有化學解聚法、物理制備法、生物解聚法和合成制備法。不同的制備方法獲得的LMWH的Mr和生物活性存在差異，相互之間不能替代使用［4］。本文對各種LMWH的制備方法進行綜述。

1 化學解聚法

化學解聚法主要是通過解聚作用制備低分子肝素，主要方法有亞硝酸解聚法、堿解聚法、過氧化物解聚法、臭氧解聚法和光化學解聚法。

1．1 亞硝酸解聚法

酸-亞硝酸鹽解聚法是研究最多的一種酸鹽結(jié)合的降解方法，其中NaNO2是最常見的解聚劑，其在酸性溶液中具有強氧化性。將多糖溶于一定濃度的稀乙酸溶液中，再緩慢滴入一定量的NaNO2溶液于室溫反應一定時間，使之發(fā)生重氮化反應，脫去一分子的N2，引起分子內(nèi)重排，使多糖中的糖苷鍵斷裂，最后用NaOH調(diào)節(jié)pH至7．0終止反應。張麗萍等［7］在反應溫度25℃左右、反應時間4 h、亞硝酸濃度0．6%、pH 2．6 的條件下，成功獲得89．95%Mr小于8 000 的LMWH。

亞硝酸解聚法已被廣泛用于LMWH的生產(chǎn)中(見表1)，但此法仍存在一些缺陷，如產(chǎn)品的原有結(jié)構(gòu)被劇烈的化學反應所破壞;糖苷鍵的隨機斷裂，造成產(chǎn)品Mr分布較寬，為后續(xù)的分離純化帶來一定的困難;生產(chǎn)過程中的污染物污染嚴重等。Shively等［8］研究了亞硝酸解聚過程中肝素的結(jié)構(gòu)組成，發(fā)現(xiàn)采用亞硝酸解聚法會使N-硫酸化的D-氨基葡萄糖轉(zhuǎn)變成脫水D-甘露糖殘基，且pH對脫氨基作用有明顯影響。另外，也發(fā)現(xiàn)酸水解會使肝素中約1/4的L-iduronosyluronic acid 2-sulfate residues轉(zhuǎn)變?yōu)闊o活性的2，5-anhydrouronic acid。

1．2 堿解聚法

在堿性條件下，肝素也能發(fā)生降解反應。例如在45℃，0．05 mol/L NaOH溶液作用16 h進行β-消除反應便可以使多糖的糖苷鍵發(fā)生斷裂。但是堿解聚法主要是引起多糖殘基上O-硫酸基團脫落和多糖鏈結(jié)構(gòu)的變化，因反應條件較劇烈使得多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變而不能保留原有的結(jié)構(gòu)特征，甚至喪失了肝素的原有功能，因此在制備LMWH時一般不采用堿降解法。

1．3 過氧化物解聚法

過氧化物解聚從反應機理上屬于氧化解聚，是研究較多且較為成熟的一種解聚普通肝素和Heparosan等多糖的方法。過氧化物具有不配對電子的氧自由基，有著極高的化學反應性。氧自由基通過氧化作用于肝素中的糖殘基使糖苷鍵斷裂，而有些還原糖則必須在堿性或金屬催化劑存在的條件下才能被氧自由基解聚［11］。

表1 商品化低分子肝素［4，9-11］

上述方法都依賴激烈的反應或是苛刻的化學試劑且都會發(fā)生個別糖殘基的降解或改變，這樣會導致一些不被預知的副產(chǎn)物產(chǎn)生。例如用堿裂解的肝素在非還原性末端的糖醛酸上會產(chǎn)生一個C4-C5雙鍵;用亞硝酸裂解在還原末端會產(chǎn)生一個脫水甘露糖［12］。此外，通過醇沉或凝膠過濾去除反應混合物中的有毒試劑還會降低LMWH的產(chǎn)量。因此，需要研究能確保安全可靠、易操作且低成本的方法制備LMWH。接下來本文介紹兩種近幾年發(fā)現(xiàn)的既安全又高效的制備LMWH的方法，即臭氧解聚法和光化學解聚法。

1．4 臭氧解聚法

近年來，研究人員常在多糖裂解酶處理后用醋酸汞去除多糖中的非還原性末端的糖醛酸，然而汞鹽具有很高的毒性，一般不用于藥物的生產(chǎn)。有研究者發(fā)現(xiàn)臭氧既可以解聚Heparosan和普通肝素，又可以消除Heparosan和LMWH的糖醛酸殘基［13］。

Masuko等［13］研究發(fā)現(xiàn)臭氧分解的LMWH、伊諾肝素、洛集帕林以及Heparosan的多糖和寡糖都消除了非還原性末端的不飽和糖醛酸，同時通過1H-NMR檢測發(fā)現(xiàn)用臭氧處理過的多糖除了在非還原性末端的不飽和糖醛酸的C4-C5雙鍵被破壞，其它結(jié)構(gòu)沒有被改變。

1．5 光化學解聚法

Higashi等［2］致力于研究光化學反應對各種多糖的降解作用，他們用TiO2催化光化學反應解聚Heparosan，成功將E．coli K5發(fā)酵生產(chǎn)的Heparosan從Mr大于15 000的解聚成8 000左右;并通過1H-NMR和電噴霧傅立葉變換質(zhì)譜檢測證明光化學解聚Heparosan是一個隨機的過程，可發(fā)生在Heparosan多糖中的葡糖醛酸或N-乙酰胺殘基，且解聚前后結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化。同時，Higashi等［1］進一步研究利用TiO2催化的光化學反應解聚硫酸化多糖-肝素，發(fā)現(xiàn)使用一個硼硅玻璃燈過濾器能成功解聚肝素，并能顯著降低解聚過程中的硫酸化基團的丟失。

2 物理制備法

物理法是一種綠色高效的方法，具有操作簡單和可控性好等特點，常用于多糖的降解研究，其中超聲波法研究的較多。超聲波與聲波一樣，是物質(zhì)介質(zhì)中的一種彈性機械波，其頻率范圍為2×104～109Hz。研究認為，超聲波降解大分子物質(zhì)的主要機理是機械性斷鍵作用以及自由基的氧化還原反應。超聲波的機械性斷鍵作用是由于物質(zhì)的質(zhì)點在超聲波中具有極高的運動加速度，產(chǎn)生激烈而快速變化的機械運動，分子在介質(zhì)中隨著超聲波的高速振動及剪切力的作用而降解。而自由基的氧化還原反應主要是由于液體在超聲波作用下產(chǎn)生空化效應而導致的。

目前，很多研究者正利用超聲波降解不同的多糖。Miyazaki［14］和 Drˇímalová 等［15］研究了超聲波對透明質(zhì)酸的解聚作用，分別研究了解聚透明質(zhì)酸過程中聲強、溫度、透明質(zhì)酸濃度、共存離子、離子強度對降解的影響，發(fā)現(xiàn)溫度越低越有利于降解，且聲強是降解的最主要影響因素。雖還未見到有關(guān)用超聲波法制備LMWH的文獻報道，但肝素、Heparosan與透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)相似，且本實驗室已做了相關(guān)實驗進行論證，證明超聲波能解聚Heparosan，據(jù)此推斷超聲波應也能用于LMWH的制備。

此外，物理法還包括物理分離法，主要有有機溶劑沉淀法如乙醇分級沉淀法、凝膠過濾法、親和色譜法、離子交換色譜法和超濾法［16］。由于普通肝素中低分子片段含量很少，所以物理分離法制備得率較低，但該法對原有結(jié)構(gòu)破壞較少，因此適用于實驗室中的結(jié)構(gòu)測定及生物活性研究，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

3 生物解聚法

生物解聚法主要是指酶解聚法。多糖裂解酶是一系列能分解糖胺聚糖(GAGs)和由糖胺聚糖所組成的蛋白聚糖(PGs)的酶，通過消除酶機制，打開酸性多糖中的特定糖苷鍵，從而得到不飽和寡聚糖產(chǎn)物，它包括肝素裂解酶、軟骨素裂解酶和透明質(zhì)酸裂解酶，其中肝素裂解酶能選擇性降解肝素并得到LMWH。肝素裂解酶有三種分別是肝素裂解酶Ⅰ(heparin lyaseⅠ，HepⅠ)、肝素裂解酶Ⅱ(HepⅡ)和肝素裂解酶Ⅲ(HepⅢ)，其中HepⅠ和HepⅢ已經(jīng)酶學委員會編號命名［9，17-18］。三種肝素裂解酶在多糖中具有不同的酶切識別位點，在制備LMWH時，使用哪種酶由產(chǎn)物特異性和反應條件共同決定。

3．1 HepⅠ

HepⅠ最早是在1985年由Yang等從Flavobacterium heparinum分離純化得到［19-20］，其作用模式是一種隨機內(nèi)分解作用，可在聚合底物的適當結(jié)構(gòu)進行隨機作用［9］。Xiao等［21］發(fā)現(xiàn)-GlcNS3S6S-IdoA2S-(GlcN 代表 2-脫氧-2-氨基-D-吡喃葡萄糖，IdoA代表L-艾杜糖醛酸，S代SO3－)是HepⅠ主要識別位點。HepⅠ的最適反應緩沖液是磷酸鹽緩沖液，最適pH是7．1，最適反應溫度為30℃［9］。由于HepⅠ穩(wěn)定性差，于4℃或冷凍保藏一段時間后活性會降低到原來的50% ～25%，且純化過程過于復雜、代價高昂，導致HepⅠ不能應用于商業(yè)化的LMWH生產(chǎn)。為此，Chen等［22］在大腸桿菌重組體中構(gòu)建了一個高效表達系統(tǒng)來生產(chǎn)可溶并有效的HepⅠ，它能融合麥芽糖錨定蛋白(MBP)，這種融合蛋白(MBP-HepⅠ)能通過多糖樹脂的進一步親和色譜而輕松獲得，成功解決了HepⅠ量產(chǎn)和分離純化這一難題。Kuang等［19］同時也進行了研究論證，成功利用MBP-HepⅠ將肝素降解成Mr小于3 000的LMWH。Ye等［12］也利用MBP-HepⅠ在超濾膜生物反應器中實現(xiàn)高效LMWH的生產(chǎn)。

3．2 HepⅡ

HepⅡ是從Flavobacterium heparinum分離得到的一種內(nèi)切酶，Mr為84 100，它可以在葡糖醛酸或艾杜糖醛酸殘基處斷開糖苷鍵。HepⅡ酶解多糖的最適反應緩沖液是磷酸鈉緩沖液，最適pH是7．1，最適反應溫度為35℃［9］。目前，尚未見文獻報道利用HepⅡ解聚制備LMWH。本實驗室正致力于HepⅡ的相關(guān)研究，且已初步證明了HepⅡ能成功解聚Heparosan，其它相關(guān)研究有待進一步探索。

3．3 HepⅢ

HepⅢ也是從Flavobacterium heparinum分離得到的一種內(nèi)切酶，是一種較易獲得的肝素裂解酶，其Mr為70 800，同時可用于驗證樣品中是否有硫酸乙酰肝素的存在。HepⅢ酶解聚多糖的最適反應緩沖液是磷酸鈉緩沖液，最適pH是7．6，最適反應溫度為35 ℃［9］。

3．4 其他裂解酶

Banga等［23］從 Aspergillus flavus(MTCC-8654)中分離到了一種與HepⅠ、HepⅡ和HepⅢ都不一樣的新型肝素降解酶，Mr為24 000。該肝素酶的最適反應溶液是300 mmol/L NaCl溶液，最適pH為7．0，最適反應溫度為30℃，其酶催化作用必須依賴半胱氨酸殘基的自由巰基的存在。適當濃度的Co2+、Mn2+和還原劑會增加其酶活;反之，酶活會因碘乙酸的存在、組氨酸的修飾以及DEPC而受到抑制。此外，通過研究證明該肝素降解酶對肝素和肝素衍生的多糖表現(xiàn)出了高度的專一性。

N-Acetyl-Heparosan Lyase(ElmA)是 Legoux 等［24］從 E．coli K5中克隆并在E．coli K12中重組表達獲得的一種內(nèi)切酶，由820個氨基酸組成，控制此酶的基因emlA被證實在E．coli K12中不存在。ElmA可以通過解聚Heparosan，用于化學酶法合成生物工程肝素，具有十分深遠的研究意義。

K5裂解酶(KflA)是 Clarke等［25］從 Coliphage K5A 中克隆并表達，為一種由635個氨基酸組成、Mr為66 900的裂解酶，其表達的氨基酸序列與E．coli SEBR 3282表達的ElmA有同源性，通過Southern blot分析證實在E．coli strains中不存在KflA基因而有elmA基因。KflA能在大范圍的pH和NaCl濃度下降解K5莢膜多糖。Rek等［26］用恒溫熒光滴定法研究KflA對不同糖胺聚糖的親和力，認為KflA能通過其在肝素羧基末端結(jié)合的配基識別特異性(乙?；?非硫酸化)和非特異性(乙酰化/硫酸化)降解位點。Murphy等［27］認為KflA能識別硫酸乙酰肝素并能在沒有硫酸化和艾杜糖醛酸的位置斷裂糖苷鍵，所以能利用KflA生產(chǎn)LMWH。

4 合成法

除了以上在普通肝素基礎(chǔ)上制備LMWH的各種方法外，還可化學合成和化學酶法合成LMWH，研究者認為此兩種方法在工業(yè)生產(chǎn)中更具競爭力。

4．1 化學合成

化學合成已經(jīng)被用于生產(chǎn)一種肝素戊糖藥物-Arixtra?，但由于其合成成本較高，因此在肝素市場中只占了很小的一部分［28］。化學合成法首先合成和天然肝素分子類似的含AT結(jié)合的戊糖序列，隨后再合成其他的寡糖并在體外測試其生物活性。經(jīng)過體外測試證明該合成肝素與普通肝素相比具有更高的抗血栓療效和較低的出血傾向性［28］。

4．2 化學酶法合成

目前，很多實驗室都在研究利用化學酶法合成肝素或肝素類似物。其主要過程是根據(jù)肝素和硫酸乙酰肝素生物合成途徑，利用克隆和表達的酶從Heparosan出發(fā)合成肝素和肝素類似物。Lindahl等［29］通過組合化學和酶法修飾E．coli K5的莢膜多糖Heparosan合成了一個具有與肝素相似的能與抗凝血酶結(jié)合，具有抗凝血和抗血栓特性的產(chǎn)品Neoheparin，且這個過程步驟簡單，成本低，易于大規(guī)模生產(chǎn)。Zhang［30］和 Wang等［31］研究發(fā)現(xiàn)從 E．coli K5 Heparosan 出發(fā)，經(jīng)過兩步化學修飾(N-脫乙?；蚇-磺化)和四步酶修飾(C5-差向異構(gòu)、2-O-磺化、6-O-磺化和選擇性酶 3-O-型磺化)獲得的肝素具有與豬來源肝素相媲美的抗凝血活性。Ly等［32］通過優(yōu)化E．coli K5的發(fā)酵條件獲得大量最適 Mr的Heparosan用于合成LMWH。Wang等［31］還發(fā)現(xiàn)在化學酶法合成過程中的關(guān)鍵步驟是Heparosan的N-脫乙?；?，N-脫乙酰的程度直接影響到生物工程肝素中N-乙酰/N-磺酸的比例，也影響了合成肝素的Mr。因此，控制好N-脫乙?；某潭饶芎芎玫馗倪M生物合成LMWH的性能。

5 展望

綜上所述，光化學解聚法制備LMWH能保持解聚樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變，能顯著降低解聚反應過程中硫酸基團的丟失，能更好的保持肝素的抗凝血活性。此外的其它化學制備LMWH方法結(jié)合部位少，容易導致硫酸基團丟失，從而影響肝素的抗凝血活性。物理法制備LMWH，過程簡單、分離純化也較容易，但產(chǎn)量有限很難應用于工業(yè)生產(chǎn)，可用于實驗室的小規(guī)模研究。而酶解聚法雖然具有高選擇性、高效性且反應條件溫和，但是較其它方法成本偏高，使用酶解聚在大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)中目前還實現(xiàn)。而化學酶法合成過程簡單，Mr易控制，合成的產(chǎn)品具有與動物來源相媲美的藥理特征，有利于大規(guī)模生產(chǎn)。因此，光化學解聚法和化學酶法合成LMWH是目前乃至今后較理想的制備方法。

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Research advances in preparation of low molecular weight heparins

YAN Zi-qin，HUANG Hai-chan，WANG Chang，ZHAO Lei，ZHONG Wei-hong
(School of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China)

RQ464．5

A

1005-1678(2012)06-0913-04

2012-02-27

國家自然科學基金項目資助(21076195)

嚴子琴，女，碩士研究生，生物化學與分子生物學專業(yè);鐘衛(wèi)鴻，通信作者，教授，博士生導師，Tel:0571-88320739，E-mail:whzhong@zjut．edu．cn。