依諾肝素鈉相對(duì)分子量的EP與USP分析方法對(duì)比研究

伯小霞，崔慧斐

(1．山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012;2．(山東大學(xué))國(guó)家糖工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250012;3．東營(yíng)天東生化工業(yè)有限公司，山東 東營(yíng) 257067)

依諾肝素鈉相對(duì)分子量的EP與USP分析方法對(duì)比研究

伯小霞1，3，崔慧斐1，2

(1．山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012;2．(山東大學(xué))國(guó)家糖工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250012;3．東營(yíng)天東生化工業(yè)有限公司，山東 東營(yíng) 257067)

目的 以國(guó)產(chǎn)依諾肝素鈉和其原研藥為樣品，比較歐洲藥典(EP)和美國(guó)藥典(USP)測(cè)定依諾肝素鈉相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)方法的差異，為國(guó)內(nèi)該品種的藥典標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考。方法 采用這兩種方法分別檢測(cè)了10批國(guó)產(chǎn)依諾肝素鈉原料藥和2批原研藥注射液LOVENOX的Mr情況。結(jié)果 USP方法測(cè)得平均Mr均較EP方法結(jié)果偏高在200以?xún)?nèi)，Mr2 000以下組分比例EP方法偏高，而Mr2 000～8 000組分比例USP方法偏高，但差距均在4%以?xún)?nèi)。國(guó)產(chǎn)依諾肝素鈉Mr與原研藥的基本一致。結(jié)論 EP和USP方法分析依諾肝素鈉Mr結(jié)果較為接近。

依諾肝素鈉;相對(duì)分子量質(zhì)量;歐洲藥典;美國(guó)藥典

依諾肝素鈉是一種低分子肝素鈉鹽，系通過(guò)對(duì)豬腸黏膜肝素的芐基酯衍生物進(jìn)行堿解聚β-消除而獲得。與其他低分子肝素一樣，依諾肝素鈉也有相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)及分布要求，并作為其鑒別的重要一項(xiàng)。依諾肝素鈉平均Mr范圍為3 800～5 000，Mr小于2 000的級(jí)分比例應(yīng)為12．0% ～20．0%，2 000～8 000的級(jí)分比例應(yīng)為68．0% ～82．0%。

歐洲藥典(EP)和美國(guó)藥典(USP)中均收錄了依諾肝素鈉，都采用高效凝膠滲透色譜進(jìn)行Mr的檢測(cè)，其具有簡(jiǎn)便、快速和重現(xiàn)性好的特點(diǎn)［1］，但兩者的分析方法卻并不完全相同［2-3］。本文采用這兩種藥典方法分析了國(guó)產(chǎn)依諾肝素鈉和原研藥LOVENOX注射液的Mr情況。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(Waters515泵，2487紫外檢測(cè)器，2414示差檢測(cè)器，7725i手動(dòng)進(jìn)樣器，81437柱溫箱);Empower工作軟件;Sartorius電子天平;Millipore超純水機(jī)。

低分子肝素Mr測(cè)定用對(duì)照品(批號(hào)2．0，數(shù)均分子質(zhì)量3 800)、EDQM依諾肝素鈉對(duì)照品(批號(hào)4．0)，歐洲藥品質(zhì)量管理局(EDQM);USP依諾肝素鈉Mr校正對(duì)照品A(批號(hào)F0H193)、USP依諾肝素鈉Mr校正對(duì)照品B(批號(hào)F0H241)、USP依諾肝素鈉對(duì)照品(批號(hào)F0I110，標(biāo)示Mr4 432)，美國(guó)藥典委員會(huì)(USP);10批依諾肝素鈉(批號(hào)KE110414等)，東營(yíng)天東生化工業(yè)有限公司;2批Lovenox依諾肝素鈉注射液(批號(hào)7880，7881)，賽諾菲-安萬(wàn)特公司;其余為國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)純或色譜純?cè)噭?/p>

2 方法

2．1 EP 分析方法［2］

2．1．1 試液的配制 流動(dòng)相:2．84%硫酸鈉溶液(用稀硫酸調(diào)節(jié)pH至5．0)。

對(duì)照品溶液:精密稱(chēng)取歐洲藥典低分子肝素Mr測(cè)定用對(duì)照品適量，用流動(dòng)相制成每1 mL約含10 mg的溶液。

供試品溶液:稱(chēng)取依諾肝素鈉適量，用流動(dòng)相稀釋成每1 mL約含10 mg的溶液。

2．1．2 色譜條件與系統(tǒng)校正 以TSKguardcolumn-SWXL和TSKgelG2000SWXL為色譜柱;柱溫為30℃;進(jìn)樣量為 25 μL;流速為 0．5 mL/min;紫外檢測(cè)器連接色譜柱出口，示差檢測(cè)器連接紫外檢測(cè)器出口;檢測(cè)波長(zhǎng)為234 nm。進(jìn)樣1%葡萄糖溶液，記錄示差色譜圖，計(jì)算理論板數(shù)與對(duì)稱(chēng)因子，理論板數(shù)應(yīng)大于20 000，對(duì)稱(chēng)因子應(yīng)為 0．8 ～1．5。進(jìn)樣 0．04%疊氮化鈉溶液，準(zhǔn)確測(cè)量紫外檢測(cè)器和示差檢測(cè)器之間的時(shí)間差。

2．1．3 分析計(jì)算 參考 EP7．0版低分子肝素 Mr鑒別項(xiàng)下方法計(jì)算［2］。

2．1．4 EP 分析方法的驗(yàn)證

2．1．4．1 精密度試驗(yàn) 按上述的方法操作，計(jì)算得RSD≤2．0%。

2．1．4．2 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 進(jìn)樣兩針EDQM依諾肝素鈉對(duì)照品，其結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)且兩針對(duì)照品的Mr分布差值≤0．5%，Mr的差值≤50。

2．2 USP 分析方法［3］

2．2．1 試液制備 流動(dòng)相:0．5 mol/L硝酸鋰溶液。

USP依諾肝素鈉對(duì)照品溶液:取USP依諾肝素鈉對(duì)照品適量，用流動(dòng)相稀釋成每1 mL約含10 mg的溶液。

USP依諾肝素鈉Mr校正對(duì)照品A和B:移取流動(dòng)相1 mL到USP依諾肝素鈉Mr校正對(duì)照品A和B瓶中，溶解混勻。

供試品溶液:取依諾肝素鈉適量，用流動(dòng)相稀釋成每1 mL約含10 mg的溶液。

2．2．2 色譜條件 以 TSKguardcolumnSWXL和 2根TSKgelG2000SWXL為色譜柱;進(jìn)樣量為20 μL;流速為0．6 mL/min;運(yùn)行時(shí)間:50 min。

2．2．3 分析計(jì)算 參考USP 33版依諾肝素鈉Mr鑒別項(xiàng)下方法計(jì)算［3］。平行樣Mr相差不超過(guò)50，對(duì)照品Mr計(jì)算結(jié)果與標(biāo)示的Mr偏差小于150，則通過(guò)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。同樣的方法，計(jì)算Mr分布。平行樣分布值相差不超過(guò)0．5%。

2．2．4 USP 分析的驗(yàn)證

2．2．4．1 精密度試驗(yàn) 按上述的方法操作，計(jì)算得RSD≤2．0%。

2．2．4．2 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 進(jìn)樣兩針USP依諾肝素鈉對(duì)照品，每一針的Mr與標(biāo)簽上標(biāo)示的Mr(4 432)相差不超過(guò)150，兩個(gè)對(duì)照品Mr之差不超過(guò)50。

2．3 采用EP和USP方法對(duì)10批依諾肝素鈉和2批Lovenox注射液進(jìn)行分析

按照EP和USP的檢驗(yàn)方法，分別分析10個(gè)批次的依諾肝素鈉樣品和2批賽諾菲-安萬(wàn)特的Lovenox依諾肝素鈉注射液樣品。

3 結(jié)果

3．1 標(biāo)準(zhǔn)品譜圖

EP和USP標(biāo)準(zhǔn)品譜圖見(jiàn)圖1～3。

圖1 EP對(duì)照品紫外與示差疊加譜圖(1-紫外譜圖，2-示差譜圖)Fig．1 The UV and RI chromatograms of heparin low-molecular-mass for calibration CRS

圖2 依諾肝素鈉Mr校正對(duì)照品A色譜圖Fig．2 The chromatogram of Enoxaparin sodium Molecular Weight Calibrant A

圖3 依諾肝素鈉Mr校正對(duì)照品B色譜圖Fig．3 The chromatogram of Enoxaparin Sodium Molecular Weight Calibrant B

3．2 樣品Mr測(cè)定結(jié)果

國(guó)產(chǎn)依諾肝素鈉和Lovenox注射液色譜圖見(jiàn)圖4～5。EP和USP分析10批依諾肝素鈉樣品和2批Lovenox樣品的結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可看出，USP方法Mr均較EP方法結(jié)果偏高，最大差值約為200，最小僅為2;Mr＜2 000的比例EP分析方法偏高，差值約為2% ～3%;Mr2 000～8 000的比例USP方法偏高，差值約為1% ～3．5%。USP方法的Mr結(jié)果更偏向范圍的中心，EP方法的結(jié)果更偏向范圍的邊緣，尤以Mr分布比例明顯。從上述數(shù)據(jù)亦可看出，10批國(guó)產(chǎn)依諾肝素鈉樣品與2批Lovenox依諾肝素鈉注射液在Mr和Mr分布方面無(wú)顯著差異。

圖4 國(guó)產(chǎn)依諾肝素鈉樣品EP方法示差譜圖Fig．4 The RI chromatogram of the domestic samples in EP method

4 討論

低分子肝素最初是在1994年被英國(guó)藥典收載入其增補(bǔ)版中，收錄了低分子肝素總則和5種低分子肝素產(chǎn)品，現(xiàn)在EP中收載的低分子肝素內(nèi)容與英國(guó)藥典相同［4］，且自收錄后該分析方法始終沒(méi)有變更。USP自31版增補(bǔ)版二開(kāi)始收錄依諾肝素鈉，2008年12月1日生效。

兩個(gè)藥典方法所采用的測(cè)定用對(duì)照品不同。USP配有自己的依諾肝素鈉Mr測(cè)定用對(duì)照品，包括7個(gè)已知分子量的窄分布Mr校正對(duì)照品(圖2～3)，另有一個(gè)Mr標(biāo)示為4 432的對(duì)照品，對(duì)檢驗(yàn)過(guò)程和結(jié)果起到指導(dǎo)作用。EP則采用數(shù)均分子量為3 800的寬分布對(duì)照品，具有普適性，適用于所有低分子肝素Mr的測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍較廣。

圖5 Lovenox注射液EP方法示差譜圖Fig．5 The RI chromatogram of the branded in EP method

表1 EP和USP方法分析10批依諾肝素鈉樣品和2批Lovenox樣品結(jié)果Tab．1 The results of 10 batches of Enoxaparin sodium samples and 2 batches brand Injection Lovenox Enoxaparin sodium in EP and USP method

雖然兩個(gè)藥典方法均采用三階標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算，但三階標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立方法有所不同。EP方法是采用數(shù)均分子質(zhì)量為3 800的寬分布對(duì)照品，利用紫外和示差雙檢測(cè)器，依據(jù)紫外與示差譜圖的峰面積得出每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Mr，以對(duì)照品溶液示差色譜圖的保留時(shí)間對(duì)示差色譜圖中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的lgMr擬合得到三階方程。USP方法則是以USP依諾肝素鈉Mr校正對(duì)照品A和B譜圖中7個(gè)峰的保留時(shí)間對(duì)各峰的Mr，用GPC軟件得到三階方程。以依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品為例，經(jīng)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中以lgMr還是直接以Mr來(lái)建立方程是EP和USP結(jié)果略有差異的主要原因。當(dāng)EP方法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以對(duì)照品溶液示差色譜圖的保留時(shí)間對(duì)示差色譜圖中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Mr來(lái)擬合，計(jì)算依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果，Mr較原結(jié)果略有升高，范圍在100左右，而Mr分布變化非常大，分布集中在2 000～8 000之間，超出標(biāo)準(zhǔn)范圍。

從本文對(duì)比研究來(lái)看，兩種藥典方法對(duì)依諾肝素鈉Mr的測(cè)定結(jié)果較為接近，Mr差別在200以?xún)?nèi)，2 000以下組分和2 000～8 000組分的比例差距均在4%以?xún)?nèi)。EP方法與USP方法相比，方法復(fù)雜，分析過(guò)程繁瑣，亦沒(méi)有標(biāo)示Mr的對(duì)照品作參考，分析過(guò)程易出現(xiàn)偏差，故筆者更傾向于USP方法。

中國(guó)藥典尚未收錄依諾肝素鈉和低分子肝素，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局于2005年頒布的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-(X-149)-2005Z低分子量肝素鈉中規(guī)定了低分子肝素鈉Mr檢測(cè)，其對(duì)照品采用EDQM低分子肝素Mr測(cè)定用對(duì)照品，檢測(cè)儀器要求、分析方法和計(jì)算均與EP一致［5］。Mr作為依諾肝素鈉同時(shí)也是低分子肝素鑒別項(xiàng)目之一，是質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中不可缺少的一項(xiàng)。本文為該品種Mr國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的制定具有參考意義。

［1］ 范慧紅，劉金秀，徐康森．低分子肝素分子量及其分布的測(cè)定［J］．中國(guó)藥學(xué)雜志，1999，34(5):332-334．

［2］ 歐洲藥典［S］．7．0 版．2011:2151-2153．

［3］ 美國(guó)藥典［S］．33版．2010:2253-2256．

［4］ 范慧紅，李 京．低分子肝素質(zhì)控研究狀況介紹［C］//2007年全國(guó)生化與生物技術(shù)藥物學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編，2007:530-532．

［5］ WS1-(X-149)-2005Z，低分子量肝素鈉［S］．

Comparative study on relative molecular weight analysis of Enoxaparin Sodium by EP and USP methods

BO Xiao-xia1，3，CUI Hui-fei1，2
(1．School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250012，China;2．National Glycoengineering Research Center(Shandong University)，Jinan 250012，China;3．Dongying Tiandong Biochemical Industry Co．，Ltd．，Dongying 257067，China)

Purpose To analyze the difference of the relative molecular weight(Mr)analysis method of Enoxaparin Sodium in european Pharmacopoeia(EP)and the United States Pharmacopoeia(USP)through the analysis of domestic samples and the branded，and to provide some opinions for Enoxaparin Sodium domestic standard．Methods Ten batches of Enoxaparin Sodium samples and 2batches brand In-jection Lovenox Enoxaparin Sodium were analyzed in EP and USP method．Results The average Mrby EP method was higher than that by USP method with difference of less than 200．The percentage of less than 2 000 by EP method was higher，and that of 2 000 ～8 000 by USP method was higher and both differences within 4%．The Mrof domestic samples was comparable to the branded．Conclusion The results of Mrof Enoxaparin Sodium by EP method were closed to those by USP method．

Enoxaparin Sodium;relative molecular weight;European Pharmacopoeia;United States Pharmacopoeia

R927．1

A

1005-1678(2012)06-0818-04

2012-05-05

十一五“重大新藥創(chuàng)制”項(xiàng)目(2008ZX09504)

伯小霞，女，在職碩士研究生，主要從事生化藥物研究與檢測(cè);崔慧斐，通訊作者，教授，碩士生導(dǎo)師，Tel:0531-88380288，E-mail:cuihuifei@sdu．edu．cn。