喜樹嫩葉中喜樹堿的HPLC提取方法的選擇

李紅英，龍 瀾，李亞杰，帥超群，程新華，黃建民，張 亮

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)創(chuàng)新中心鄂西綜合試驗站，湖北 恩施445000;2.恩施清江生物工程有限公司，湖北 恩施 445000)

喜樹堿(Camptothecin,CPT)是我國特有樹種喜樹(CamptothecaacuminateDecne)中所含的一種具有顯著抗癌活性的生物堿[1-2]，其抗癌機理是通過抑制拓撲異構(gòu)酶I發(fā)揮細胞毒性[3-4].相關(guān)報道已對喜樹的嫩葉與成葉中喜樹堿含量做了對比實驗[5]，研究結(jié)果表明嫩葉中喜樹堿含量明顯高于成葉.而我們已經(jīng)研究了同一地區(qū)不同時間采摘喜樹嫩葉的含量差別，得到了湖北建始喜樹嫩葉的最高含量為3.25‰.已有的喜樹堿含量測定方法中均以甲醇或乙醇浸提數(shù)次的方法來提取喜樹堿[6-8]，提取時間長，且不易提取完全.本實驗以喜樹嫩葉為原料，對喜樹堿不同提取方法進行比較.

1 試劑、試藥和儀器

1.1 試劑與試藥

乙腈由(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色普純)提供； 水為二次重蒸餾水；甲醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純)；其余試劑由均為市售分析純；喜樹堿(CPT)對照品(上海源葉科技有限公司)純度98.5%；喜樹嫩葉采集自湖北省恩施州宣恩縣.

1.2 儀器

Waters 2695分離單元 Waters2996二極管矩陣檢測器;Waters色譜柱恒溫箱Empower2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，Al204電子天平;KQ-50E型超聲波清洗器，SZ-93型自動雙重純水蒸餾器.溶劑過濾器等實驗室常規(guī)儀器.

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定法

2.1.1 色譜條件 Waters Symmetry C18柱(150×3.9 mm，5 μm),流動相：乙腈∶水=35∶65(V/V)，流速1.0 mL/min檢測波長254 nm，柱溫：25℃，進樣量10 μL.

2.1.2 標準溶液的制備 精密稱取喜樹堿標準品10.0 mg于100 mL容量瓶，以甲醇(色譜純)為溶劑超聲溶解并定容至刻度，搖勻備用.臨用時取5 mL備用液于50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度,搖勻即可.

2.1.3 線性關(guān)系 精密吸取標準溶液0.1、0.4、0.8、1.5、3、6 mL置于10 mL的容量瓶中，分別用純甲醇定容至刻度，搖勻.在以上色譜條件下進行分析，每個樣品連續(xù)進樣5次，記錄圖譜及色譜參數(shù)，分別以喜樹堿濃度(y,單位：μg/mL)和峰面積(x)進行線性回歸方程為：y=6.05x×10-5-2.547,R=0.999 7,線性范圍：4.04～43.96 μg/mL.

2.1.4 精密度實驗 取同一標準品溶液，在色譜條件下連續(xù)進樣5次，喜樹堿的平均峰面積為138 940，標準差為8 424，RSD=1.15%(n=5).

2.1.5 穩(wěn)定性實驗 取同一樣品溶液，在色譜條件下進樣，每隔2 h測一次，連續(xù)測定7次，在12 h內(nèi)喜樹堿的平均峰面積為1 588 034.6，標準差為152 126.3，RSD=4.77%，說明樣品溶液在12 h內(nèi)是穩(wěn)定.

2.1.6 重復(fù)性試驗 取同一樣品5份，精密稱定，按2.1.3方法提取，將樣品溶液注入液相色譜儀，喜樹堿的平均峰面積為2 589 336，標準差為8 855.36，RSD=3.01%，表明重復(fù)性符合要求.

表1 各方法喜樹堿提取率 ‰

2.2 提取率的計算

喜樹堿提取率與樣品濃度(μg/mL)、樣品體積(mL)及樣品質(zhì)量(g)的關(guān)系按以下公式計算：提取率‰=濃度×體積/樣品質(zhì)量×103×10-6.

2.3 樣品溶液的提取方法選擇

精確稱取喜樹嫩葉粉末，分別用甲醇提取法與堿法，重復(fù)3次，用HPLC測定提取液中喜樹堿含量.以喜樹堿的提取率為考察指標進行比較，結(jié)果見表1.

2.3.1 甲醇提取法 精密稱取喜樹嫩葉粉末(過60目篩)1 g 4份于4個100 mL容量瓶，分別加入80 mL 60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、無水甲醇(分析純)，于50℃下超聲提取1 h，冷至室溫，加各種濃度的甲醇稀釋至刻度，搖勻，用針頭式過濾膜過濾提取液，取過濾液10 μL進樣.

2.3.2 堿法 精密稱取喜樹嫩葉粉末(過60目篩)1 g 3份于3個100 mL錐形瓶中，分別加入0.05、0.1、0.2 mol/L的NaOH溶液20 mL,浸泡30 min后，常溫下超聲提取1 h，離心，傾出提取液.再加入相同體積的NaOH溶液在相同條件下提取1 h，共提取3次，合并提取液.滴加鹽酸調(diào)節(jié)至pH值為4～5，離心定容.

2.4 干燥方法

取喜樹嫩葉于80℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重即可.

2.5 流動相的選擇

實驗以乙腈—水體系為流動相，體積比在25∶75～60∶40之間時喜樹堿的保留時間為3.9～8.59 min，最終選擇乙腈—水(35∶65)為流動相，喜樹堿的分離度良好，且喜樹堿峰的理論塔板數(shù)高于4000，在此條件下，做出的喜樹堿標樣和喜樹嫩葉的圖譜如圖1、2所示.

圖1 喜樹堿對照品 圖2 喜樹嫩葉樣品

2.6 樣品結(jié)果分析

結(jié)果表明：喜樹堿提取率純甲醇>80%甲醇>70%甲醇>60%甲醇>0.2 mol/L NaOH>0.1 mol/L NaOH>0.05 mol/L NaOH.

從實驗結(jié)果可以看出，甲醇提取法明顯優(yōu)于堿提法，甲醇的濃度對喜樹堿的提取率有極顯著影響.但是純甲醇的提取率與80%甲醇的提取率沒有明顯的變化，而且從經(jīng)濟利益出發(fā)，篩選出從喜樹嫩葉中提取喜樹堿的最佳工藝條件：稱取樣品1 g于100 mL容量瓶中，加80%甲醇溶液90 mL，50℃超聲提取1 h,冷卻至室溫，離心取樣，進行分析.

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