FOXP1和pVHL在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

陳建歐，萬(wàn)麗，陳霖，黃卡特，吳秀玲

（1.溫州市第八人民醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 病理科，浙江溫州 325000）

腎細(xì)胞癌占成人腎臟惡性腫瘤的80%，居泌尿系統(tǒng)腫瘤第二位，每年全世界約9.5萬(wàn)人死于腎癌，約1/3腎癌患者初診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，其生物學(xué)行為極為多變，難以預(yù)測(cè)[1]。了解腎細(xì)胞癌的形成機(jī)制、提高預(yù)后評(píng)估水平對(duì)患者的治療具有重要的意義。

基因變異在腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，CCRCC）的發(fā)生中發(fā)揮重要的作用，尤其是染色體3p位點(diǎn)缺失或突變，可見(jiàn)于96%的散發(fā)性CCRCC，其中VHL基因（3p25）變異是CCRCC的典型特征。VHL基因通過(guò)其蛋白產(chǎn)物pVHL降解低氧誘導(dǎo)因子（HIF）、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等發(fā)揮抑制腫瘤的作用[2]。pVHL是一種多功能蛋白，不僅能抑制VHL依賴(lài)性腎細(xì)胞癌的生長(zhǎng)，而且在維持p53穩(wěn)定性、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境調(diào)節(jié)中亦起關(guān)鍵作用[3]。FOXP1屬于叉頭轉(zhuǎn)錄因子家屬，位于3p14.1，是新近發(fā)現(xiàn)的候選腫瘤抑制基因，在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、分化和增殖過(guò)程中起重要作用。FOXP1在正常組織中主要表達(dá)于細(xì)胞核，而在腫瘤細(xì)胞中則可出現(xiàn)異常表達(dá)，即胞漿、胞膜或胞核、胞漿同時(shí)表達(dá)，除B細(xì)胞惡性淋巴瘤外[4]，F(xiàn)OXP1在其他各種腫瘤中的臨床意義尚不清楚。據(jù)報(bào)道，CCRCC的FOXP1的表達(dá)率高達(dá)90%[5]。本研究旨在探討FOXP1在CCRCC中的表達(dá)和定位情況，及其與臨床病理參數(shù)和pVHL表達(dá)的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 一般資料 收集2008年2月-2009年12月經(jīng)病理確診的CCRCC患者共48例，其中男38例，女10例，年齡32～68歲，平均52歲。臨床表現(xiàn)為腰部不適、血尿21例，其余均為體檢發(fā)現(xiàn)。腫塊位于左腎31例，右腎17例，大小為3～8 cm。pT1期19例，pT2期15例，pT3/pT4期14例。病理分級(jí)：G1 10例，G2 25例，G3 13例。8例伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，10例伴出血和壞死。均行腎癌根治術(shù)。

1.2 檢測(cè)方法 所有標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡觀察。免疫組織化學(xué)染色采用Envision二步法。FOXP1特異性單克隆抗體（JC12抗體，由英國(guó)牛津大學(xué)Banham AH饋贈(zèng)，工作濃度為1:80）及pVHL（北京中杉公司產(chǎn)品，工作濃度為1:50）兩種免疫組化標(biāo)記，操作均按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以反應(yīng)性增生的扁桃體作FOXP1陽(yáng)性對(duì)照，以已知的腎透明細(xì)胞癌標(biāo)本作pVHL陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。FOXP1染色結(jié)果判定：腫瘤細(xì)胞無(wú)表達(dá)定義為陰性，胞漿、胞核、胞膜表達(dá)定義為陽(yáng)性；每例均選擇表達(dá)最強(qiáng)區(qū)域計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，定義1%～10%陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為0（陰性），11%～30%為 1（弱表達(dá)），31%～70%為2（中度表達(dá)），>70%為3（強(qiáng)表達(dá)）[6]。pVHL染色結(jié)果判定：胞漿或胞膜淺黃至棕黃色為陽(yáng)性，不著色為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 使用SPSS12.0軟件，F(xiàn)OXP1和pVHL兩者表達(dá)與臨床病理參數(shù)用x2和Fisher檢驗(yàn)，兩者的相關(guān)性用Speaman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 FOXP1在CCRCC中的表達(dá) 正常腎組織中，近曲小管FOXP1胞漿陽(yáng)性，遠(yuǎn)曲小管和集合管胞核呈陽(yáng)性表達(dá)，腎小球和細(xì)段呈陰性或弱表達(dá)（見(jiàn)圖1）。48例CCRCC患者中FOXP1陰性者8例（占16.7%），弱表達(dá)者23例（占47.9%），中至強(qiáng)表達(dá)者17例(占35.4%)，其中胞核、胞漿同時(shí)表達(dá)者9例，胞膜、胞漿同時(shí)表達(dá)者3例，余28例僅胞漿表達(dá)（見(jiàn)圖2-3）。13例高級(jí)別CCRCC中有8例FOXP1陽(yáng)性表達(dá)，而35例低級(jí)別CCRCC中有32例FOXP1陽(yáng)性表達(dá)，高級(jí)別組明顯低于低級(jí)別組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），F(xiàn)OXP1在各臨床分期中表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05），在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CCRCC和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CCRCC病例中，F(xiàn)OXP1的表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞ 0.05）（見(jiàn)表1）。

2.2 pVHL在CCRCC中的表達(dá) 正常腎小管、腎小球pVHL呈弱表達(dá)。48例CCRCC患者中呈胞漿陽(yáng)性者25例（占52.1%）（見(jiàn)圖4）。pVHL表達(dá)與腫瘤分級(jí)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05），見(jiàn)表1。

圖1 FOXP1在正常腎組織中的表達(dá)情況（×200）

圖2 CCRCC中FOXP1胞核與胞漿同時(shí)表達(dá)（×200）

圖3 CCRCC中FOXP1胞膜與胞漿同時(shí)表達(dá)（×100）

圖4 CCRCC中pVHL胞漿表達(dá)（×200）

2.3 FOXP1與pVHL表達(dá)的相關(guān)性 48例CCRCC中9例胞核、胞漿同時(shí)表達(dá)，此9例CCRCC中8例pVHL陽(yáng)性，其余31例FOXP1非胞核、胞漿同時(shí)表達(dá)的CCRCC中17例pVHL陽(yáng)性，F(xiàn)OXP1胞核表達(dá)與pVHL表達(dá)具有正相關(guān)關(guān)系（r=0.594，P＜0.05）。

3 討論

FOXP1屬于叉頭/翼狀轉(zhuǎn)錄因子FOX家族成員之一，其cDNA開(kāi)放讀碼區(qū)包含677個(gè)氨基酸，由質(zhì)粒pAB195cDNA序列的249～2279個(gè)核苷酸編碼。據(jù)動(dòng)物及體外實(shí)驗(yàn)等結(jié)果報(bào)道，F(xiàn)OXP1具有廣泛的功能，從調(diào)節(jié)B細(xì)胞發(fā)育、單核細(xì)胞分化到促進(jìn)心肌細(xì)胞和肺的發(fā)育[6-7]。FOXP1在不同器官中功能不同，F(xiàn)OXP1基因敲除會(huì)導(dǎo)致胚胎鼠死亡，而缺乏FOXP1表達(dá)的心肌增殖活性增加[7]。

表1 FOXP1、pVHL表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

FOXP1在不同的組織中其蛋白表達(dá)的水平及定位也不同，如在次級(jí)淋巴濾泡中，大部分邊緣區(qū)B細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，而生發(fā)中心B細(xì)胞中FOXP1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率在10%～50%之間[7]；正常腎組織近曲小管中FOXP1胞漿陽(yáng)性表達(dá)，在遠(yuǎn)曲小管和集合管中胞核呈陽(yáng)性表達(dá)，腎小球和細(xì)段中呈陰性或弱表達(dá)[6]。不僅如此，F(xiàn)OXP1在不同的腫瘤中其臨床意義也不同，在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中胞核過(guò)表達(dá)預(yù)示腫瘤預(yù)后較差；在MALT型淋巴瘤中胞核高表達(dá)預(yù)示腫瘤惡性轉(zhuǎn)化[4]；在乳腺癌中胞核表達(dá)與雌激素受體密切相關(guān)，且預(yù)示患者無(wú)瘤生存時(shí)間較長(zhǎng)[8]。FOXP1蛋白在細(xì)胞中定位的區(qū)分化以及多種生物學(xué)功能意味著FOXP1轉(zhuǎn)錄因子在不同腫瘤中存在不同的調(diào)節(jié)機(jī)制。

本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)FOXP1在48例CCRCC中的表達(dá)及定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其陽(yáng)性表達(dá)率為83.3%，與Toma等[5]對(duì)22例CCRCC研究發(fā)現(xiàn)FOXP1蛋白表達(dá)率達(dá)90%的結(jié)果基本一致。FOXP1在腫瘤細(xì)胞中既有胞漿表達(dá)又有胞膜表達(dá)或胞核、胞漿同時(shí)表達(dá)，表明FOXP1參與CCRCC的發(fā)生，其蛋白定位的不同提示FOXP1在CCRCC中存在著多種發(fā)生機(jī)制。本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP1在低級(jí)別CCRCC中表達(dá)率明顯高于高級(jí)別的CCRCC，表明FOXP1與CCRCC惡性程度有關(guān)。

3號(hào)染色體短臂（3p）的雜合性缺失是CCRCC常見(jiàn)的基因事件，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)此區(qū)存在多個(gè)腫瘤抑制基因，如VHL（3p25）、DUTTI/ROBO1（3p12-13）、FHIT（3p14.1）和FOXP1（3p14.1）等，其中VHL變異是CCRCC特征性的基因改變，多數(shù)基因的功能發(fā)揮有賴(lài)于此基因的失活[2，9]，因此VHL基因被認(rèn)為是“看家”基因。VHL mRNA編碼的蛋白pVHL包含213個(gè)氨基酸殘基，仍保留了腫瘤抑制功能。pVHL通過(guò)與elongins B、elongins C等結(jié)合形成VEC-E3泛素連接酶復(fù)合物，降解HIF-1途徑抑制腫瘤生長(zhǎng)，這一作用機(jī)制已被證實(shí)，并已應(yīng)用于臨床治療。除此以外，pVHL還能促進(jìn)腎細(xì)胞分化與生長(zhǎng)，通過(guò)Mdm2途徑修復(fù)DNA酶，而且在維護(hù)P53核因子的穩(wěn)定，調(diào)節(jié)纖維連接蛋白基質(zhì)信號(hào)，以及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[2-3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CCRCC中 pVHL陽(yáng)性表達(dá)率為52.1%，呈胞漿和胞膜表達(dá)。而Magyarlaki等[10]報(bào)道CCRCC中pVHL陽(yáng)性表達(dá)率為71.6%，多為胞膜表達(dá)，胞漿表達(dá)多見(jiàn)于高級(jí)別CCRCC，兩者結(jié)果稍有差異。本研究發(fā)現(xiàn)pVHL與CCRCC的臨床分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)，提示pVHL異常僅在部分CCRCC形成中起關(guān)鍵作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)9例FOXP1胞核、胞漿同時(shí)陽(yáng)性的CCRCC中8例pVHL陽(yáng)性。而B(niǎo)anham等[7]研究10例CCRCC、1例嫌色細(xì)胞癌及1例乳頭狀腎細(xì)胞癌，發(fā)現(xiàn)FOXP1陽(yáng)性定位既可在胞核，也可在胞漿或兩者均有，同時(shí)發(fā)現(xiàn)4例伴有VHL基因突變或VHL綜合征的CCRCC中3例FOXP1呈胞核表達(dá)，與本研究結(jié)果類(lèi)似，推測(cè)FOXP1可能單獨(dú)或依賴(lài)于VHL基因的缺失或突變，調(diào)節(jié)促進(jìn)CCRCC的發(fā)生發(fā)展。至于FOXP1是否如已經(jīng)證實(shí)的P53腫瘤抑制蛋白的胞核運(yùn)輸一樣[11]，在pVHL調(diào)節(jié)下改變了轉(zhuǎn)錄方式，需做進(jìn)一步探討。

綜上所述，F(xiàn)OXP1在CCRCC中存在高表達(dá)，可能參與腫瘤形成的早期階段，其胞核表達(dá)與pVHL蛋白的相關(guān)性值得我們進(jìn)一步探討。

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