天津漢族群體D21S11、D21S1440和Penta D STR基因座遺傳多態(tài)性的研究*

史云芳 孫 璐 李 巖 李曉洲 張秀玲 張 穎 岳天孚

天津漢族群體D21S11、D21S1440和Penta D STR基因座遺傳多態(tài)性的研究*

史云芳 孫 璐 李 巖 李曉洲 張秀玲 張 穎△岳天孚

目的：研究天津漢族群體21號(hào)染色體上D21S11、D21S1440和Penta D 3個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）基因座遺傳多態(tài)性，為唐氏綜合征（DS）基因診斷和產(chǎn)前基因診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：收集天津無親緣關(guān)系的漢族個(gè)體332例，定量熒光PCR（QF-PCR）擴(kuò)增STR基因座，ABI PRISM 377測序儀檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)3個(gè)STR基因座的基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。計(jì)算3個(gè)STR基因座的基因型頻率、觀察雜合度（Ho）、多態(tài)信息量（PIC）、個(gè)體識(shí)別率（DP）、非父排除率（PE）等群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。結(jié)果：D21S11、D21S1440和Penta D 3個(gè)STR基因座分別檢出6、4、8個(gè)等位基因，基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。3個(gè)基因座的Ho分別為0.617、0.705、0.867，PIC分別為0.755、0.596、0.795，DP分別為0.916、0.794、0.931，PE分別為0.312、0.436、0.730。結(jié)論：D21S11、D21S1440和Pen?ta D STR基因座在天津漢族群體雜合度高，是21號(hào)染色體良好的遺傳標(biāo)記，對(duì)DS的基因診斷有指導(dǎo)意義。

串聯(lián)重復(fù)序列 唐氏綜合征 多態(tài)現(xiàn)象，遺傳 聚合酶鏈反應(yīng) 天津 D21511 D215144 Penta D

短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）是一種以2~6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的簡單串聯(lián)重復(fù)基因片段，廣泛分布在各種真核生物基因組中。國內(nèi)外常采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測與21號(hào)染色體相關(guān)的STR基因座進(jìn)行唐氏綜合征（Down syn?drome，DS）的基因診斷。但STR的基因頻率和雜合度有地區(qū)和種族差異，用于基因診斷時(shí)必須篩選出本地區(qū)雜合度高的STR基因座。本實(shí)驗(yàn)研究天津漢族群體21號(hào)染色體上D21S11、D21S1440和Penta D 3個(gè)STR基因座的遺傳多態(tài)性，為DS基因診斷和產(chǎn)前基因診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2003年9月—2007年12月在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科優(yōu)生遺傳門診進(jìn)行遺傳咨詢、染色體核型分析正常且無親緣關(guān)系的天津漢族個(gè)體332例，其中男164例，女168例，年齡20~43歲。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 靜脈取血2 mL，EDTA抗凝，采用鹽析法提取DNA。根據(jù)NCBI的UiSTS數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unists）和文獻(xiàn)[1]，選擇D21S11、D21S1440和Penta D 3個(gè)STR基因座。正向引物5'端均由熒光染料5-羧基-熒光素（caboxyfluorescein-5-succimidyl ester，F(xiàn)AM）標(biāo)記，引物序列由北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，見表1。

Table 1 The characters of STR loci D21S11,D21S1440 and Penta D表1 D21S11、D21S1440和Penta D STR基因座特征

1.2.2 熒光定量PCR（QF-PCR）擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測 PCR反應(yīng)體系 25 μL，1×PCR buffer，dNTPs 0.2 mmol/L，模板 DNA約0.6 ng，引物濃度為 0.12 μmol/L。PCR 擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃ 2 min；變性95 ℃ 30 s，退火59 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，共32個(gè)循環(huán)；延伸72℃ 5 min后60℃保溫30 min，4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，4%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，ABI PRISM 377自動(dòng)測序儀掃描電泳圖，用GeneScan 3.1軟件和Binthere軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)提取、分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 直接計(jì)數(shù)法觀察各位點(diǎn)的等位基因頻率，觀察到的基因型頻率用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，驗(yàn)證是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。采用PowerStatsV12軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分別計(jì)算3個(gè)STR基因座的觀察雜合度（heterozy?gosity of observation，Ho）、多態(tài)信息量（polymorphism informa?tion content，PIC）、個(gè)體識(shí)別率（probability of discrimination power，DP）和非父排除率（probability of exclusion，PE）等群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 3個(gè)基因座基因頻率分布 332例樣本均擴(kuò)增成功。D21S11 STR基因座共發(fā)現(xiàn)6種等位基因，等位基因片段長度分別為220、224、228、232、236、240 bp，由小到大依次命名為1~6。D21S1440 STR基因座共發(fā)現(xiàn)4種等位基因，等位基因片段長度分別為157、160、163、166 bp，由小到大依次命名為 1~4。Penta D STR基因座共發(fā)現(xiàn)8種等位基因，等位基因片段長度分別為398、403、408、413、418、423、428、433 bp，由小到大依次命名為1~8，見表2、圖1。

Table 2 The allele frequencies of D21S11,D21S1440 and Penta D STR loci表 2 D21S11、D21S1440和Penta D STR基因座等位基因頻率

Figure 1 The allele ladders of D21S11,D21S1440 and Penta D STR loci圖1 D21S11、D21S1440和Penta D STR基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)階梯

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 對(duì)D21S11、D21S 1440和Penta D 3個(gè)STR基因座的基因型分布進(jìn)行檢驗(yàn)，其基因型觀察值與期望值吻合良好（χ2分別為336.00、90.00、648.00，均P>0.05），基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。各基因座基因型分布見表3~5。

Table 3 Genotype frequencies of STR locus D21S11表3 D21S11 STR基因座的基因型分布

Table 4 Genotype frequencies of STR locus D21S1440表4 D21S1440 STR基因座的基因型分布

2.3 遺傳多態(tài)性統(tǒng)計(jì) 天津漢族群體D21S11、D21S1440和Penta D STR基因座Ho、PIC、DP和PE等群體多態(tài)性數(shù)據(jù)見表6。

3 討論

STR又稱微衛(wèi)星、簡單重復(fù)序列（Simple se?quence repeats，SSRs），在人類基因組中分布較廣，具有信息量大、易于檢測、高度多態(tài)性并遵循孟德爾共顯性遺傳等特點(diǎn)，廣泛用于基因作圖、篩選目的基因、遺傳病連鎖分析、群體遺傳學(xué)研究、法醫(yī)個(gè)體識(shí)別、親權(quán)鑒定及器官移植等方面。自從1993年Mansfield等首次報(bào)道利用熒光定量PCR擴(kuò)增STR基因座診斷染色體數(shù)目異常以來，國內(nèi)外已有較多研究將STR基因座用于產(chǎn)前診斷[2-3]。但STR基因座的基因頻率和雜合度因群體、地域不同而不同，只有篩選出雜合度高、多態(tài)信息量大的STR基因座，才有可能對(duì)DS進(jìn)行基因診斷和產(chǎn)前基因診斷。本研究從Genbank中選擇21號(hào)染色體DS關(guān)鍵區(qū)內(nèi)部及附近的3個(gè)STR基因座進(jìn)行研究，為建立適合天津漢族群體的DS快速基因診斷和產(chǎn)前基因診斷方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前少見天津漢族群體D21S1440的遺傳多態(tài)性數(shù)據(jù)。

Table 5 Genotype frequencies of STR locus Penta D表5 Penta D STR基因座的基因型分布

Table 6 The genetic polymorphism parameters of 3 STR loci表6 3個(gè)STR基因座遺傳多態(tài)性參數(shù)

Demeter等[4]研究羅馬尼亞特蘭西瓦尼亞地區(qū)2個(gè)匈牙利人群D21S11基因座的遺傳多態(tài)性，分別發(fā)現(xiàn)15和14個(gè)等位基因片段，其Ho、PIC、DP和PE分別為0.838 1和0.911 0、0.840 7和0.837 1、0.961 4和0.950 6、0.671 6和0.817 9。Okamoto等[5]發(fā)現(xiàn)在日本人群中D21S11基因座有12個(gè)等位基因，其Ho、PIC、DP和PE分別是0.740 1、0.744 7、0.916 8和0.493 0。西安[6]和浙江[7]漢族人群中D21S11基因座分別檢出12和17個(gè)等位基因，其Ho、PIC、DP和PE分別是0.849 8和0.824、0.796 9和 0.83、0.943 2和 0.947、0.645（浙江）。本研究中D21S11 STR基因座發(fā)現(xiàn)6個(gè)等位基因，天津漢族群體D21S11 STR基因座Ho為0.617，略低于文獻(xiàn)報(bào)道，可能與人種間及地區(qū)間基因的分布不同有關(guān)。DP值為0.916，接近文獻(xiàn)報(bào)道。PE值為0.312，略低于文獻(xiàn)報(bào)道。值得注意的是天津漢族群體D21S11 STR基因座PIC較高，為0.755，適用于個(gè)體識(shí)別的研究。

D21S1440 STR基因座國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道較少見。劉世明等[8]研究21號(hào)染色體上8個(gè)STR基因座的遺傳多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)D21S1440基因座有5個(gè)等位基因片段，其中Ho和PIC分別為0.548 4和0.458 2。本研究中天津漢族群體D21S1440 STR基因座檢出4個(gè)等位基因，Ho為 0.705，PIC為 0.596，DP為0.794，PE為0.436，滿足Ho＞ 0.70的要求，是Ho較高的STR基因座，可以用于DS的基因診斷。

Penta D STR基因座在日本人[5]中Ho為0.768 4，PIC為0.774 2，DP為0.932 2，PE為0.541 7。北京[9]、河南[10]地區(qū)Penta D基因座分別發(fā)現(xiàn)15和9個(gè)等位基因，Ho、PIC、DP和 PE 分別為 0.813 9和 0.824 1、0.787 8和 0.771 0、0.931 7和 0.924 0、0.634 9和0.632 5。Penta D基因座在本研究中檢出8個(gè)等位基因，Ho為 0.867，PIC 為 0.795，DP為 0.931，PE 為0.730，與以上文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。結(jié)果表明Penta D STR基因座具有很高的多態(tài)信息量，是DS基因診斷和個(gè)體識(shí)別的首選基因座。

本研究發(fā)現(xiàn)21號(hào)染色體上D21S11、D21S1440和Penta D STR基因座在天津漢族群體中有較高的雜合度，是21號(hào)染色體良好的遺傳標(biāo)記。聯(lián)合筆者早期研究的D21S1411和D21S1413基因座[11]，可用于DS的基因診斷和產(chǎn)前基因診斷，從而有效地預(yù)防DS患兒的出生。后續(xù)研究還將篩選13、18、X、Y染色體上的STR基因座，診斷這些染色體的數(shù)目異常。

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Genetic Polymorphisms of STR Loci D21S11，D21S1440 and Penta D in Tianjin Han Population

SHI Yunfang,SUN Lu,LI Yan,LI Xiaozhou,ZHANG Xiuling,ZHANG Ying,YUE Tianfu

Department of Obstetrics and Gynecology,General Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China

Objective:To investigate the genetic polymorphisms of 3 short tandem repeat(STR)loci D21S11，D21S1440 and Penta D on chromosome 21 in Tianjin Han population and to provide basic data for the use of 3 STR loci in gene diagnosis and prenatal gene diagnosis of Down syndrome(DS).Methods:Blood samples were collected from 332 unre?lated individuals of Tianjin Han population.QF-PCR and ABI PRISM 377 DNA sequencer were used.The frequencies of the genotypes were tested with Hardy-Weinberg equilibrium.Genetic analysis was performed to conclude some data of popula?tion genetics such as the frequency of the alleles，the heterozygosity of observation(Ho)，the polymorphism information content(PIC)，the probability of discrimination power(DP)and the probability of exclusion(PE).Results:Six,four and eight alleles of D21S11，D21S1440 and Penta D were observed respectively.The frequencies of the genotypes were in good agreement with Hardy-Weinberg equilibrium.The Ho of 3 STR loci were 0.617,0.705 and 0.867.The PIC were 0.755,0.596 and 0.795.The DP were 0.916,0.794 and 0.931.The PE were 0.312,0.436 and 0.730.Conclusion:D21S11，D21S1440 and Penta D STR loci had high heterozygosity in Tianjin Han population,which were good genetic markers of chromosome 21 and can be used in gene diagnosis and prenatal gene diagnosis of DS.

tandem repeat sequences down syndrome polymorphism,genetic polymerase chain reaction TIAN?JIN D21511 D215144 Penta D

10.3969/j.issn.0253-9896.2012.08.001

*天津市科技攻關(guān)課題（項(xiàng)目編號(hào)：06YFSYSF01800）；天津市教委資助課題（項(xiàng)目編號(hào)：20050229）

300052 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科（史云芳，李巖，李曉洲，張秀玲，張穎，岳天孚）；天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院（孫璐）

△通訊作者 E-mail：tjzyyzy@yahoo.com.cn

（2012-02-06收稿 2012-04-14修回）

（本文編輯 李鵬）

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