中國(guó)刺參（♂）×日本紅刺參（♀）雜交子代的胚胎、幼體發(fā)育及幼參生長(zhǎng)性狀的研究＊

孫秀俊，李 琪，孔令鋒，于瑞海

（中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266003）

中國(guó)刺參（♂）×日本紅刺參（♀）雜交子代的胚胎、幼體發(fā)育及幼參生長(zhǎng)性狀的研究＊

孫秀俊，李 琪＊＊，孔令鋒，于瑞海

（中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266003）

本研究建立中國(guó)刺參（♂）與日本紅刺參（♀）雜交組合，通過對(duì)雜交子代的胚胎發(fā)育進(jìn)行觀察，詳細(xì)描述其胚胎及幼體各個(gè)階段的發(fā)育時(shí)序和形態(tài)特征，并比較在幼參培育期間雜交苗與中國(guó)刺參自交苗的生長(zhǎng)和成活。結(jié)果表明，在20～22℃時(shí)，雜交子代發(fā)育至初耳幼體的時(shí)間為受精后24 h 38 min，發(fā)育至中耳幼體的時(shí)間為72 h 8 min，然后經(jīng)過167 h 8 min（約7d）發(fā)育至大耳幼體，到受精后第9天發(fā)育至樽形幼體。樽形幼體后期，纖毛環(huán)逐漸退化，浮游能力減弱，幼蟲由浮游轉(zhuǎn)至底棲生活。在幼參培育期間，受精后第38～51天，平均水溫為25.2℃，雜交幼參的體重特定生長(zhǎng)率（SGR）為2.58%，而自交幼參的SGR略高，為3.03%；從受精后第51～80天，平均水溫達(dá)到27.17℃，雜交幼參的生長(zhǎng)速度減慢，SGR減小至0.66%，但平均體質(zhì)量明顯增加，到第80天達(dá)到（0.34±0.035）g，而自交幼參活動(dòng)能力減弱，攝食量明顯減少，SGR減小至0.08%，生長(zhǎng)近于停滯，到第80天平均體質(zhì)量為（0.19±0.034）g。自交苗和雜交苗的成活率相差不顯著，分別為82.2%和73.9%。這表明，在高溫條件下雜交苗種比自交苗種生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)明顯。

刺參；雜交；胚胎發(fā)育；生長(zhǎng)

刺參（Apostichopus japonicus）隸屬于棘皮動(dòng)物門（Echinodermata）、海參綱（Holothuroidea）、楯手目（Aspidochirota）、刺參科（Stichopodidae），主要分布在我國(guó)的遼寧、山東、河北等沿海省，朝鮮半島、日本和俄羅斯遠(yuǎn)東沿海，是我國(guó)重要的特種海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)物。近年來(lái)，隨著海參市場(chǎng)需求的不斷增長(zhǎng)，我國(guó)刺參養(yǎng)殖呈現(xiàn)迅猛發(fā)展態(tài)勢(shì)，養(yǎng)殖產(chǎn)量不斷增加，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2008年我國(guó)刺參總產(chǎn)量已達(dá)到92 567 t，其中超過95%來(lái)自山東和遼寧2個(gè)?。?］。然而，隨著生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大、產(chǎn)量的增加，卻出現(xiàn)了苗種質(zhì)量下降、養(yǎng)殖刺參生活力降低和疾病頻發(fā)等問題，尤其是在高溫季節(jié)幼參生長(zhǎng)停滯、死亡慘重，嚴(yán)重制約了海參養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。因此，進(jìn)行刺參的遺傳改良、培育高產(chǎn)抗逆新品種，對(duì)我國(guó)刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)和區(qū)域經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展愈顯重要。

雜交育種仍是目前國(guó)內(nèi)外動(dòng)植物遺傳育種中應(yīng)用最廣泛、成效最顯著的育種方法之一，也是水產(chǎn)動(dòng)物育種的重要途徑之一。由于雜種優(yōu)勢(shì)的存在，雜交能迅速和顯著地提高雜種的產(chǎn)量或生活力，因此，利用雜種優(yōu)勢(shì)獲得水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)、存活等表型性狀改良的研究，國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道。目前雜交育種已廣泛應(yīng)用于魚類［2－5］和貝類［6－10］等水產(chǎn)動(dòng)物中的育種實(shí)踐，并且在提高生長(zhǎng)速度、抗病力、抗逆性、出肉率、成活率、餌料轉(zhuǎn)化率和改良肉質(zhì)等方面取得了一定的成效。雜交工作包括種間雜交和種內(nèi)雜交，對(duì)于海洋無(wú)脊椎動(dòng)物，種間雜交往往會(huì)由于親緣關(guān)系相距較遠(yuǎn)，而出現(xiàn)雜交不親和、幼體不成活和雜種后代育性差等難以解決的問題，而種內(nèi)雜交不存在此類問題，可操作性強(qiáng)，容易推廣，是雜種優(yōu)勢(shì)利用的主要途徑［11］。

在日本，野生刺參存在紅刺參、黑刺參和青刺參3個(gè)品系。Kanno等［12－13］分別采用同工酶標(biāo)記和微衛(wèi)星分析了3種體色刺參的遺傳差異，結(jié)果顯示紅刺參與其他兩色刺參之間存在明顯的遺傳分化，并且推測(cè)可能存在生殖隔離。Sun等［14］通過比較3種顏色刺參的線粒體全基因組，證明三者在分類地位上屬于同1個(gè)種。紅刺參肉體較厚，市場(chǎng)價(jià)格較高，一般為青、黑刺參的2～3倍。鑒于其優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，2006年中國(guó)海洋大學(xué)從日本成功引進(jìn)紅刺參新品種，開展了紅刺參和中國(guó)刺參的近緣雜交技術(shù)研究，胡美燕和李琪［15］報(bào)道了日本紅刺參♀×中國(guó)刺參♂雜交組在幼蟲期和稚參期的各生長(zhǎng)性狀平均值均大于其它3組雜交和自交組合，雜種優(yōu)勢(shì)率均較為明顯。本研究采用此最優(yōu)雜交組合，以紅刺參為母本，中國(guó)刺參為父本，對(duì)雜交子代胚胎發(fā)育各個(gè)階段的發(fā)育時(shí)序和形態(tài)特征進(jìn)行詳細(xì)的描述，并比較在高溫條件下雜交幼參和中國(guó)刺參自交幼參的生長(zhǎng)和成活，以期為刺參雜交苗種培育提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

日本紅刺參采自日本大分縣，中國(guó)刺參采自我國(guó)乳山沿海。以中國(guó)刺參為父本，紅刺參為母本進(jìn)行雜交。親參蓄養(yǎng)和苗種的培育均在海陽(yáng)市海泰育苗場(chǎng)進(jìn)行。采用陰干升溫法誘導(dǎo)種參產(chǎn)卵，親參陰干1 h，流水刺激40 min，隨后將種參放入升溫海水中（較原親參蓄養(yǎng)水溫升高3～5℃），待其排精、產(chǎn)卵。2009年4月27日收集紅刺參的卵子和中國(guó)刺參的精子，混合受精，建立雜交實(shí)驗(yàn)組；同時(shí)收集中國(guó)刺參的精子和卵子，混合受精后建立中國(guó)刺參自交實(shí)驗(yàn)組。幼體培育在50 L的塑料水桶中進(jìn)行，培育密度為0.5個(gè)／m L，培育初期的水溫維持在20～22℃，海水鹽度30～32，當(dāng)自然海水溫度達(dá)到20℃以上時(shí)，采用常溫海水進(jìn)行培育。

浮游幼體培育期間，投喂餌料種類包括牟式角毛藻和小新月菱形藻，日投餌2次，投餌量根據(jù)胃部飽滿度和生長(zhǎng)發(fā)育的情況而定。日換水2次，每次換水量為1／3～1／2，持續(xù)充氣。定期隨機(jī)抽樣觀察30個(gè)耳狀幼體，目微尺測(cè)定體長(zhǎng)。當(dāng)20%～30%的耳狀幼體發(fā)育至樽形時(shí)投放附著基。幼參培育期間投喂鼠尾藻、馬尾藻和海帶等人工配合飼料，日投餌2次，投餌量根據(jù)稚參攝食情況而定。日換水2次，每次換水1／3～1／2，根據(jù)池底糞便量和殘餌量每隔7～10 d倒池1次。在受精后第38、51和80天測(cè)量幼參體質(zhì)量，體重特定生長(zhǎng)率（SGR）按照下面的公式計(jì)算：SGR（%·d－1）＝100（ln W2－ln W1）／T。其中，W1和W2分別為幼參開始的體質(zhì)量，T為持續(xù)的天數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 自交苗和雜交苗胚胎和幼體發(fā)育過程中的外部形態(tài)特征

雜交子代和自交子代的胚胎及幼體發(fā)育時(shí)間見表1。圖1和2分別為雜交子代和自交子代的發(fā)育圖譜。中國(guó)刺參自交子代與雜交子代的胚胎和幼體發(fā)育時(shí)序完全相同，但是發(fā)育至各個(gè)階段的時(shí)間略有不同。雜交子代發(fā)育至大耳幼體的時(shí)間為167 h 8 min，而自交子代發(fā)育至大耳幼體的時(shí)間略長(zhǎng)，為211 h 32 min。雜交子代的變態(tài)附著比自交子代提前1 d左右的時(shí)間。現(xiàn)以雜交子代的胚胎及幼體發(fā)育為例，詳細(xì)描述各個(gè)階段的形態(tài)特征。

受精卵：受精卵為沉性卵，卵黃均勻透明，受精卵的平均卵徑為（175.91±3.56）μm。受精后約30 min，出現(xiàn)第一極體（見圖1－1）。

卵裂：卵子受精后52 min進(jìn)入第1次細(xì)胞分裂。第1次分裂為縱裂，形成2個(gè)大小相等分裂球（見圖1－2）。第2次也為縱裂，與第1次分裂面相垂直，產(chǎn)生4個(gè)大小相等的分裂球（見圖1－3）。第3次為橫裂，產(chǎn)生8個(gè)大小相等的分裂球（見圖1－4）。受精卵經(jīng)多次分裂，細(xì)胞數(shù)量不斷增加，細(xì)胞體積越來(lái)越?。ㄒ妶D1－5）。

表1 中國(guó)刺參（♂）與日本紅刺參（♀）雜交子代和中國(guó)刺參自交子代的胚胎及幼體發(fā)育（水溫20～22℃）Table 1 Embryonic and larval development of the inbred and hybrid between Green（♂）and Red（♀）sea cucumber（Temperature：20～22℃）

囊胚期：受精后5 h 29 min，多次卵裂之后，細(xì)胞界限開始模糊，胚體中央出現(xiàn)1個(gè)大而且圓的空腔，形成囊胚腔（見圖1－6）。

原腸期：受精后13 h 22 min，囊胚拉長(zhǎng)，經(jīng)過內(nèi)陷后形成原腸腔，到原腸后期，原腸腔向胚體一側(cè)傾斜，成為幼體腹側(cè)，原口形成肛門（見圖1－7）。

初耳幼體：受精后24 h 38 min，幼體臂形成，消化系統(tǒng)開始完善，可以明顯區(qū)分口、食道、胃、腸和肛門等消化器官，原體腔和水體腔均未發(fā)育（見圖1－8）。

中耳幼體：受精后72 h 8 min，幼體臂粗壯而且明顯，體長(zhǎng)明顯增長(zhǎng)，左側(cè)原體腔開始延長(zhǎng)，水體腔未延長(zhǎng)（見圖1－9）。

大耳幼體：受精后167 h 8 min，出現(xiàn)5對(duì)球狀體，體長(zhǎng)進(jìn)一步增長(zhǎng)，左側(cè)原體腔進(jìn)一步發(fā)育，長(zhǎng)度超過胃長(zhǎng)的一半，水體腔延長(zhǎng)，到大耳后期，在水體腔外側(cè)形成5個(gè)囊狀五觸手原基（見圖1－10）。

樽形幼體：受精后9 d，耳狀幼體不斷收縮，纖毛帶失去連續(xù)性，逐漸變?yōu)閳A筒形，體長(zhǎng)縮小為原來(lái)的一半左右，內(nèi)部消化器官很難分辨，即發(fā)育至樽形幼體。到樽形后期，幼體纖毛運(yùn)動(dòng)能力減弱，活動(dòng)緩慢，主要集中于水的中下層（見圖1－11）。

五觸手幼體：受精后10 d，5個(gè)觸手伸出前庭，形成五觸手幼體（見圖1－12）。

稚參：受精后11 d，身體拉長(zhǎng)，在幼體腹面左側(cè)后端形成第一管足，隨后管足數(shù)量不斷增加，并在幼體體表形成許多鈣質(zhì)骨片，形態(tài)與成體海參基本相似（見圖1－13）。

圖1 中國(guó)刺參（♂）×日本紅刺參（♀）雜交苗種的胚胎幼體發(fā)育和幼參生長(zhǎng)Fig.1 Embryonic，larval development and juvenile growth of the hybrid between Green（♂）and Red（♀）sea cucumber

圖2 中國(guó)刺參自交子代的胚胎幼體發(fā)育和幼參生長(zhǎng)Fig.2 Embryonic，larval development and juvenile growth of the inbred Green

圖3 自交子代和雜交子代幼體的體長(zhǎng)生長(zhǎng)Fig.3 Laval growth of the inbred and hybrid sea cucumber

2.2 浮游幼體的生長(zhǎng)

隨著培育天數(shù)增加，自交子代和雜交子代浮游幼體的體長(zhǎng)不斷增加，到受精后第10天均達(dá)到最大值，分別為（680.57±54.92）μm和（638.18±55.62）μm（見圖3）。自交子代和雜交子代的體長(zhǎng)生長(zhǎng)率，在7 d分別為73.35和59.38μm／d；在10 d，由于幼體發(fā)育至樽形階段，身體收縮，體長(zhǎng)減小，分別為59.40和46.39μm／d。自交子代和雜交子代幼體的平均體長(zhǎng)在7 d和10 d均差異不顯著。

2.3 雜交幼參和自交幼參的生長(zhǎng)及成活比較

由圖4可知，受精后第38天，自交幼參和雜交幼參的平均體質(zhì)量之間存在顯著差異（P＜0.05），雜交幼參的平均體質(zhì)量為（0.20±0.07）g，自交幼參的平均體質(zhì)量為（0.13±0.04）g。從第38～51天，水溫保持在25℃左右（平均水溫為25.2℃），雜交苗的體質(zhì)量特定生長(zhǎng)率（SGR）為2.58%，而當(dāng)?shù)刈越幻绲腟GR略高，為3.03%，到第51天，兩者之間的平均體質(zhì)量差異不顯著（P＞0.05）。從受精后第51～80天，水溫上升至27℃以上（平均水溫為27.2℃），雜交苗的生長(zhǎng)速度略有減慢，SGR減小為0.66%，但平均體質(zhì)量明顯增加，到第80天為（0.34±0.035）g，而在此期間，自交苗活動(dòng)能力明顯減弱，攝食量減少，SGR減小至0.08%，生長(zhǎng)近于停滯，第80天平均體質(zhì)量為（0.19±0.034）g，此時(shí)雜交幼參和自交幼參之間的平均體質(zhì)量差異極顯著（P＜0.01）。

另外，隨著培育天數(shù)的增加，自交苗和雜交苗的個(gè)體間體質(zhì)量差異逐漸增大，尤其是雜交苗的體質(zhì)量差異極為懸殊，在第80天時(shí)，最重的雜交苗個(gè)體為3.58 g，最輕的個(gè)體不足0.01 g；而最重的自交苗個(gè)體僅為0.77 g，最輕的個(gè)體也不足0.01 g。從受精后第38天到第80天，自交苗的成活率為82.2%，雜交苗成活率略低，為73.9%。第80天雜交幼參的背面觀和腹面觀見圖1－14和圖1－15。雜交幼參的背部呈黃褐色，偏向于中國(guó)刺參，腹部縱帶為紅色，偏向于紅刺參，并且刺型優(yōu)良，具有中國(guó)刺參和紅刺參的共同特征。

圖4 中國(guó)刺參（♂）×日本紅刺參（♀）雜交幼參和中國(guó)刺參自交幼參的平均體質(zhì)量Fig.4 Comparison of body weight of the hybrid（Green♂×Red♀）and inbred juveniles（Green）

3 討論

水產(chǎn)動(dòng)物育種中，利用種內(nèi)不同地理種群雜交進(jìn)行生長(zhǎng)性狀的改良，已應(yīng)用于扇貝、鮑魚和馬氏珠母貝等水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)種類，并取得了一定的進(jìn)展［16－18］。相對(duì)于種間雜交，種內(nèi)雜交不容易產(chǎn)生種質(zhì)污染，有利于經(jīng)濟(jì)種類的種質(zhì)資源保護(hù)。因此，為解決我國(guó)養(yǎng)殖刺參生活力降低、疾病頻發(fā)等問題，種內(nèi)雜交育種是培育刺參優(yōu)良品種的重要途徑之一。

本實(shí)驗(yàn)描述了中國(guó)刺參（♂）與日本紅刺參（♀）的種內(nèi)雜交后代的胚胎及幼體各個(gè)階段的發(fā)育時(shí)序和形態(tài)特征。雜交子代受精卵的卵裂期直徑為（220±6.33）μm，略大于于東祥等［19］報(bào)道的刺參卵徑（140～170μm）。雜交子代的胚胎和幼體發(fā)育與中國(guó)刺參完全一致，但各個(gè)階段的發(fā)育時(shí)間略有不同。在20～22℃時(shí)，中國(guó)刺參自交后代與雜交后代發(fā)育至初耳幼體的時(shí)間大致相同（24 h左右）；前者經(jīng)過第8天發(fā)育至大耳幼體，而雜交子代在第7天時(shí)即發(fā)育至大耳幼體；自交后代第10天時(shí)發(fā)育至樽形幼體，而雜交后代到第9天發(fā)育至樽形幼體。胡美燕等［15］的研究中也發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于其他雜交或自交組合，日本紅刺參♀×中國(guó)刺參♂的雜交子代在耳狀幼體期間體長(zhǎng)的生長(zhǎng)最快，表現(xiàn)出一定程度的雜種優(yōu)勢(shì)（4.60%～6.90%），第8天生長(zhǎng)率為67.8 μm／d，略高于本研究中第7天的生長(zhǎng)率（59.38μm／d）。這表明，雜交苗在浮游幼體階段發(fā)育速度較快，較于東祥等［18］報(bào)道的發(fā)育至樽形幼體時(shí)間提前1d左右。

在幼參培育階段，當(dāng)平均水溫為25.2℃時(shí)，雜交苗的SGR略低于當(dāng)?shù)刈越幻绲腟GR，但在夏季高溫時(shí)期（水溫27℃以上），雜交苗的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于自交苗。在此期間，自交苗活動(dòng)能力減弱，攝食量明顯減少，生長(zhǎng)近于停滯（SGR為0.08%），而雜交苗的生長(zhǎng)率隨著水溫的升高雖然也出現(xiàn)相應(yīng)的下降（SGR為0.66%），但是下降幅度有限。這表明，在高溫條件下，雜交苗較自交苗存在明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。胡美燕和李琪［15］也發(fā)現(xiàn)了日本紅刺參♀×中國(guó)刺參♂的雜交后代存在一定的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，經(jīng)過160 d的生長(zhǎng)發(fā)育，這個(gè)組合的雜交后代在體長(zhǎng)和體重增長(zhǎng)方面優(yōu)勢(shì)非常明顯，雜種優(yōu)勢(shì)率分別為8.39%～18.85%和23.21%～49.77%。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)幼參培育期間雜交苗的成活率略低于自交苗。王小兵等［20］的研究結(jié)果表明，單一的不同地理群體間的雜交所獲得的子代，尤其對(duì)于雜交群體來(lái)自引進(jìn)種群的雜交子代，雖然在生長(zhǎng)速度上具有相當(dāng)?shù)碾s種優(yōu)勢(shì)，但對(duì)于本地環(huán)境的適應(yīng)能力較差。因而，在充分利用日本紅刺參和中國(guó)刺參雜交子代生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，應(yīng)制定切實(shí)可行的選擇育種方案提高雜交子代適應(yīng)本地環(huán)境的能力。

本研究通過對(duì)中國(guó)刺參（♂）和日本紅刺參（♀）雜交子代的胚胎發(fā)育和浮游幼體生長(zhǎng)的觀察，以及雜交和中國(guó)自交幼參生長(zhǎng)和成活的比較，證實(shí)雜交與自交

后代幼體階段的發(fā)育時(shí)序和形態(tài)特征基本一致，雜交苗發(fā)育至大耳幼體和樽形幼體的時(shí)間較自交苗短，在高溫時(shí)期，雜交幼參存在明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。此外，雜交刺參的體色美觀，刺型優(yōu)良，進(jìn)一步開展雜交苗種的選擇育種研究，有望培育出生長(zhǎng)速度快、成活率高和抗逆能力強(qiáng)的刺參優(yōu)良新品系。

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Embryonic，Larval Development and Juvenile Growth in Hybrid Between Green（♂）and Red（♀）Sea Cucumber Apostichopus japonicus

SUN Xiu－Jun，LI Qi，KONG Ling－Feng，YU Rui－Hai
（The Key Laboratory of Mariculture，Ministry of Education，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

In present study，intraspecific hybridization was carried out between Green sea cucumber（♂）and Red sea cucumber（♀），Apostichopus japonicus.The embryonic development of hybrids was observed and the morphological characteristics of each period were described detailedly.Moreover，the growth rates and survival between hybrid juveniles and inbred Green juveniles were compared.At 20～22℃，the hybrid larvae required 24 h 38 min to develop to early auricularia，72 h 8 min to develop to mid－auricularia，and 167 h 8 min to develop to late auricularia.Furthermore，the hybrid larvae required 9 to develop to doliolaria.During the late stage of doliolaria，with the loss of cilia band，the larvae sank and became to settle on the bottom.From 38 to 51 after hatching，the average water temperature was 25.17℃，specific growth rate for weight（SGR）in the hybrid juveniles was 2.58%，while inbred juveniles grew at slightly higher SGR（3.03%）.When the average water temperature rose to 27.17℃from 51 to 80 d，despite the growth rate of hybrid juveniles slowed down with SGR decreased by 0.66%，the average weight increased to（0.34±0.035）g at 80 d after hatching.However，with the decreased food intake of inbred juveniles，the SGR dropped sharply to a extremely low value（0.08%），with the average weight of（0.19±0.034）g at 80 d.There was no significant difference on survival between hybrid and inbred juveniles（82.2%and 73.9%）.This indicated that the advantages of growth characteristics in the hybrid juveniles under the higher water temperature were obvious.

Apostichopus japonicus；hybridization；embryonic development；growth

S917.4

A

1672－5174（2012）04－026－07

山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2009GG10005013）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)基金項(xiàng)目（20090132110018）資助

2011－04－09；

2011－08－18

孫秀?。?981－），男，博士生，從事水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種學(xué)研究。E－mail：sxjrenp＠hotmail.com

＊＊通訊作者：E－mail：qili66＠ouc.edu.cn

責(zé)任編輯 王 莉