人晶狀體細胞膜衰老模型的建立△

竺向佳 葉鴻飛 盧奕

膜磷脂分子的運動主要有4種方式：側(cè)向擴散、旋轉(zhuǎn)運動、伸縮運動及翻轉(zhuǎn)擴散(又稱為翻轉(zhuǎn))。當(dāng)脂質(zhì)雙分子層內(nèi)的水分子通透性改變時，膜磷脂排列的疏密性和有序性會受到顯著影響，磷脂分子的運動性發(fā)生改變，進而影響整個細胞膜的流動性。6-酰基-2-二甲氨基萘(6-dodecanoyl-2-dimethylaminonaphthalene,Laurdan)是一種對細胞膜水分子通透性改變非常敏感的探針，可以把膜流動性的改變用不同波長下測得的熒光強度比例，即總極化(generalized polarization，GP)值來定量體現(xiàn)[1]。GP值越小，細胞膜流動性越強。

關(guān)于晶狀體的細胞膜流動性，既往研究有限，多數(shù)通過觀察某個影響膜流動性的因素，間接評估整個細胞膜的流動性，具有一定的局限性。我們的前期研究[2]利用人晶狀體組織，通過Laurdan染色和雙光子共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)合ImageJ和Photoshop圖像分析，實現(xiàn)了對晶狀體不同區(qū)域細胞膜流動性的定點和定量分析，是一種全新的研究方法，反映了整個細胞膜的狀態(tài)。利用該方法，我們對晶狀體細胞膜流動性的年齡相關(guān)性改變，進行了年齡層次跨度較大的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，年輕晶狀體從內(nèi)到外各區(qū)域的細胞膜流動性幾乎恒定；隨年齡的增長，晶狀體中央部分的細胞膜流動性不斷增加，而距中心3.5 mm以外最新合成的皮質(zhì)區(qū)域細胞膜流動性卻保持恒定。那么這種晶狀體細胞膜的年齡相關(guān)性改變能否通過某種模型來模擬呢？

Heys等[3]將完整的晶狀體置于50 ℃溫和熱應(yīng)激下，以模擬晶狀體在35 ℃體溫長期作用下發(fā)生的年齡相關(guān)性改變。該模型表現(xiàn)為晶狀體內(nèi)可溶性晶狀體蛋白(α、β、γ)的含量下降，α晶狀體蛋白高分子量(high molecular weight,HMW)的形成繼而下降，以及晶狀體硬度增加，因此是一個較理想的體外實驗?zāi)Ｐ汀１狙芯康闹髦紕t在于闡明晶狀體加熱模擬晶狀體細胞膜年齡相關(guān)性改變的可行性。

1 材料與方法

1.1 人晶狀體獲取 人晶狀體由Lions NSW眼庫(悉尼，澳大利亞)提供，3對(年齡分別為30、41、63歲)，于捐獻者死亡后3～14 h內(nèi)取出，迅速置入-80 ℃冰箱保存。人體標(biāo)本的使用遵從赫爾辛基宣言，并獲得悉尼大學(xué)人體研究倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：# 7292)。

1.2 完整晶狀體加熱 于3對晶狀體中每對各取1個，置于15 mL離心管制成的濕潤容器中，密封后置于50 ℃烘箱內(nèi)加熱20 h(圖1A)。

1.3 冷凍切片制作 將3對晶狀體(加熱及未加熱)全部行冷凍切片(Leica公司,德國)。方法如下：虹膜面朝下，將晶狀體用最佳切削溫度包埋劑包埋并固定于標(biāo)本盤上，制作厚度為10 μm的完整冠狀切片；取晶狀體中間部分的切片并按順序標(biāo)記，室溫下放置1 h后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 Laurdan染色 將4 μL Laurdan (Invitrogen公司,澳大利亞)加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)中，制備成50 μmol/L溶液。每張切片滴入40 μL Laurdan溶液，室溫避光放置30 min，PBS沖洗3次后瀝干；滴入40 μL 4%多聚甲醛，室溫避光固定20 min，PBS沖洗3次，擦干標(biāo)本周邊液體，封片后室溫避光過夜，4 ℃保存。

圖1. 加熱模型及圖像采集處理方法示意圖

A.取15 mL離心管制成濕潤容器，加入100 μL水以防蒸干；B.圖像采集示意圖，圖中大橢圓形為晶狀體的冠狀切片，小方形為每個視野采集的圖像，連續(xù)采集775×775 μm2的數(shù)幀圖像，每張圖像邊緣部分重疊，直至覆蓋整個切片的長軸；C.1和2為同一個視野2個通道的信號強度圖像，3和4為經(jīng)軟件轉(zhuǎn)換后的GP圖像和HSB圖像；D.用Photoshop軟件測量距離切片中心(M點)0、0.75、2、3、3.5、4、4.5 mm 各位點處的GP值，各位點均測量3次，每個晶狀體選取3張連續(xù)切片

1.6 晶狀體切片加熱 另取2個晶狀體(年齡分別為28和47歲)，冰凍切片步驟同前；各取中央部位3張切片置于密封濕盒，于50 ℃烘箱加熱20 h；取3張未加熱的中央?yún)^(qū)切片。對所有切片進行Laurdan染色，行圖像采集分析及GP值計算。

2 結(jié)果

對于每對完整的晶狀體(30、41、63歲)，經(jīng)50 ℃加熱20 h的一側(cè)晶狀體較未加熱的對側(cè)晶狀體，距中心3.5 mm范圍內(nèi)的GP值均明顯下降(圖2)，而3.5 mm以外區(qū)域的GP值基本不變?？v向?qū)Ρ?對不同年齡的晶狀體，可見3.5 mm內(nèi)的GP值隨年齡增長呈明顯下降趨勢。HSB圖像顏色變化可反映GP值的變化，黃至紅色表示GP值較高，細胞膜流動性較差；綠色者則GP值較低，細胞膜流動性較好。對比每對晶狀體的HSB圖像，發(fā)現(xiàn)加熱的晶狀體較未加熱的晶狀體圖像表現(xiàn)有顯著差異；經(jīng)加熱的30歲晶狀體與未加熱的41歲晶狀體表現(xiàn)相似，而經(jīng)加熱的41歲晶狀體與未加熱的63歲晶狀體更為相似(圖3)。

圖3. 不同年齡的晶狀體經(jīng)50 ℃ 20 h加熱者和未加熱者晶狀體GP值改變的HSB圖像

GP值越小，顏色越偏綠，細胞膜流動性越強

對于28歲及47歲的晶狀體切片，其HSB圖像可見加熱后晶狀體切片內(nèi)部區(qū)域偏向于綠色(圖4)。分析GP值后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)50 ℃加熱20 h后距中心3.5 mm范圍內(nèi)的GP值明顯下降(圖5)，3.5 mm以外范圍的GP值基本不變。

圖4. 28歲和47歲的晶狀體切片經(jīng)50 ℃ 20 h加熱者和未加熱者晶狀體GP值改變的HSB圖像

GP值越小，顏色越偏綠，細胞膜流動性越強

3 討論

細胞膜的流動性是指構(gòu)成細胞膜的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分子的運動性，主要表現(xiàn)為膜磷脂分子的運動。磷脂雙分子層構(gòu)成了細胞膜的基本支架，其輕油般的液態(tài)結(jié)構(gòu)具有流動性，這種流動性可以反映細胞膜的功能狀態(tài)及膜受損傷程度[4]。流動性不僅是細胞膜的基本特性之一，也是細胞進行生命活動的必要條件，參與細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜的融合、胞吞作用及膜結(jié)合酶功能的維持等。

當(dāng)細胞膜的結(jié)構(gòu)變得疏松時，更多的水分子通透入脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，使其極性升高。這一特性可通過發(fā)射光譜為溶劑極性依賴的熒光探針檢測出，用以評估膜致密程度的改變。Laurdan即為此類探針，可插入細胞膜內(nèi)，與磷脂分子的疏水端平行排列。它的定位和發(fā)射光譜不受磷脂頭基和表面修飾的影響，通過檢測水分子通透的變化以體現(xiàn)整個細胞膜的疏密程度和流動性[5]。Bagatolli等[6]利用膜結(jié)構(gòu)內(nèi)水分子通透改變時Laurdan表現(xiàn)的發(fā)射光譜紅移或藍移特性，總結(jié)得到GP值的計算公式，為細胞膜流動性的進一步量化提供了基礎(chǔ)。

我們的前期研究[2]利用Laurdan染色來觀察人的晶狀體組織切片，通過GP值計算，可以實現(xiàn)對整個晶狀體細胞膜流動性的定點和定量分析。觀察22～83歲的23對晶狀體切片，發(fā)現(xiàn)在20～40歲的晶狀體中，從外到內(nèi)的細胞膜流動性幾乎恒定。隨著年齡的增長，距離晶狀體中心約3.5 mm半徑范圍內(nèi)的細胞膜流動性不斷增加，距中心越近越明顯；而3.5 mm以外即新合成的皮質(zhì)區(qū)域內(nèi)，細胞膜的流動性幾乎保持不變[2]。但是這種現(xiàn)象尚無有效的模型來重現(xiàn)。

Heys等[3]研究表明，隨著年齡增長，晶狀體中各種可溶性晶狀體蛋白含量逐漸下降；30歲以后，大部分游離α晶狀體蛋白開始聚集為α晶狀體蛋白HMW，后者進一步變性，溶解度下降并沉淀。該作者還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)50 ℃溫和熱應(yīng)激的完整晶狀體也會出現(xiàn)細胞內(nèi)可溶性晶狀體蛋白(α、β、γ)含量下降，HMW形成并最終變性，以及晶狀體硬度增加等類似于年齡相關(guān)性的晶狀體改變[7]。因此認(rèn)為，可用50 ℃加熱晶狀體的方法，研究晶狀體長時間在體溫作用下發(fā)生的年齡相關(guān)性改變。

本研究對晶狀體進行了加熱，旨在闡明其模擬晶狀體細胞膜年齡相關(guān)性改變的可行性。結(jié)果顯示，加熱后30歲晶狀體的HSB圖像與未加熱41歲晶狀體表現(xiàn)相似，而加熱后41歲晶狀體與未加熱63歲晶狀體表現(xiàn)類似；測量GP值后發(fā)現(xiàn)，加熱后晶狀體中央3.5 mm內(nèi)的細胞膜流動性明顯增加，與前期年齡相關(guān)性研究中觀察到的膜流動性改變一致，且兩者的GP值改變具有可比性，進一步說明了長時期處于35 ℃的體溫環(huán)境可能是晶狀體衰老的重要原因之一。

需要指出的是，冷凍后的晶狀體脆性增加，行冷凍切片時較困難，靠近周邊的組織易發(fā)生卷曲或碎裂，導(dǎo)致組織損失。本實驗中，63歲晶狀體切片距中心4.5 mm的組織完整，而其他年齡晶狀體距該位點處組織已發(fā)生損失，因此僅得到4.0 mm以內(nèi)各處的相應(yīng)數(shù)據(jù)。

此外，我們還進行了單獨晶狀體切片的溫和熱應(yīng)激實驗，結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)50 ℃加熱20 h后28歲和47歲的晶狀體切片，尤其是距離中心3.5 mm范圍內(nèi)均出現(xiàn)了GP值下降，即細胞膜流動性增加，這也與年齡相關(guān)性改變相符。另外,由于單個晶狀體可以制作多個切片，且切片的加熱過程更為簡單，在晶狀體來源有限的條件下，可以有效節(jié)約標(biāo)本資源。

同時，50 ℃加熱溫度與晶狀體所處的某些實際環(huán)境差別并不大。例如，將猴子暴露于49 ℃中午陽光下，晶狀體的溫度可以在9 min內(nèi)達到41.5 ℃[8]。膜脂質(zhì)本身在這一溫度下的改變似乎并不是觀察到的細胞膜流動性增加的原因，因為在其他的實驗中發(fā)現(xiàn)，即便把晶狀體在70 ℃加熱20 h，也未觀察到明顯的膜磷脂變化。

值得注意的是，無論是完整晶狀體還是晶狀體切片，加熱與未加熱者細胞膜流動性的變化均以距晶狀體中心3.5 mm區(qū)為界，可能與該位置的屏障作用有關(guān)。有研究[9-10]顯示，該屏障的作用自中年開始逐漸明顯，阻礙小分子物質(zhì)如谷胱甘肽等抗氧化物在晶狀體核區(qū)及皮質(zhì)區(qū)之間的流通，促使該區(qū)域內(nèi)部的晶狀體核相關(guān)蛋白發(fā)生翻譯后修飾[11]，可能為年齡相關(guān)性核性白內(nèi)障的發(fā)生機制提供依據(jù)[12]。

綜上所述，晶狀體50 ℃加熱是模擬晶狀體細胞膜流動性年齡相關(guān)性改變的有效模型，可以很好地用于今后晶狀體細胞膜流動性方面的研究。

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