十種熱帶雨林植物光活化抗微生物活性的篩選

胡 昀,陳 玉

(1中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074；2 中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，武漢 430074)

光敏劑在可見光或紫外光照射下將分子氧變成活性氧從而產(chǎn)生抗微生物活性[1]。光動(dòng)力抗微生物化學(xué)療法(PACT)就是利用光敏劑的光化學(xué)活性產(chǎn)生的活性氧殺死致病菌，光敏劑對(duì)致病菌的損傷比對(duì)機(jī)體細(xì)胞或組織大的多，因此抗微生物化學(xué)療法備受關(guān)注[2]。從植物中尋找具有光調(diào)節(jié)生物活性的物質(zhì)是發(fā)現(xiàn)新型光敏劑的重要途徑之一，這些化合物在醫(yī)藥和綠色農(nóng)藥的研究中具有重要的理論價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景，受到當(dāng)今醫(yī)藥和農(nóng)藥界的重視.從天然樣品中發(fā)現(xiàn)新型結(jié)構(gòu)的活性天然產(chǎn)物是天然產(chǎn)物化學(xué)研究的首要任務(wù)，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，至今已從天然資源中發(fā)現(xiàn)了約15萬種結(jié)構(gòu)不同的天然化合物，尤其是來源于過去研究較少的熱帶雨林植物[3]，它是發(fā)現(xiàn)新型結(jié)構(gòu)活性天然產(chǎn)物的重要寶庫之一.

本文通過系統(tǒng)溶劑法分別提取了10種熱帶雨林植物(見表1)，通過濾紙擴(kuò)散法篩選這10種植物的光活化抗微生物活性，并用薄層色譜生物自顯影技術(shù)確定了活性化合物的部位.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

植物材料由云南西雙版納民族醫(yī)藥研究所提供和鑒定，其植物名稱、編號(hào)和所屬科名見表1[4,5].

表1 十種植物材料的拉丁文名

1.1.2 供試菌種

金黃色葡菌球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、草分枝桿菌(Mycobacteiumphlei)、環(huán)狀芽胞桿菌(Bacilluscirculans)由中南民族大學(xué)生科院微生物教研室提供.

1.1.3 藥品與試劑

薄層層析硅膠(GF254)-鋁薄板(武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司)，瓊脂(天津市天達(dá)凈化材料精細(xì)化工廠)，苯酚紅(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)，M-H培養(yǎng)基(Mueller-Hinton Broth，杭州微生物試劑廠，含酸水解酪蛋白、牛肉浸出粉、淀粉)，M-H瓊脂培養(yǎng)基(Mueller-Hinton Agar，含Muller-Hinton Broth粉末、0.7%瓊脂、0.002%苯酚紅、硫酸卡那霉素，武漢華順生物技術(shù)有限公司)，8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(ACROS ORGANICS公司).

1.2 植物材料的提取

各種植物材料稱取50g 并粉碎，用甲醇提取后，溶于甲醇和水 (1︰9) 的混合溶劑中，用石油醚萃取，得石油醚提取物.甲醇和水層脫溶后，加水溶解，依次用乙酸乙酯，正丁醇萃取，這樣就獲得了石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4個(gè)提取物.

稱取3種蕓香科植物竹葉椒莖木(ZanthoxylumarmatumDC.)，野花椒(ZanthoxylumutileHuang)，狗花椒(Zanthoxylumplanispinumsieb.et Zucc.) 各50g，粉碎后，用甲醇提取，得甲醇提取物.再用2 %的HCl溶解和乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯層脫溶后用甲醇和水 (體積比1︰9) 溶解，接著用石油醚萃取，分別得到非生物堿部分的石油醚和乙酸乙酯提取物.酸水層用10 %NaOH調(diào)pH值至9，依次用氯仿和正丁醇萃取，得脂溶性和水溶性生物堿.

1.3 生物活性測(cè)定

1.3.1 濾紙擴(kuò)散法

[6]，將各提取物的濃度分別配成10 mg/mL的樣品溶液，選用直徑為6 mm的滅菌濾紙片，每張濾紙片中加10 μL樣品，待溶劑揮發(fā)后，將已點(diǎn)樣的濾紙圓片貼于已涂布各菌懸液200 μL(菌液濃度106～107cfu/mL)的M-H瓊脂培養(yǎng)基，放置20min后，其中一組在紫外光(320～400nm)照射1 h后，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，第二天測(cè)抑菌圈大小，比較其在黑暗中和紫外光照射后抗微生物活性的大小.

1.3.2 薄層色譜自顯影技術(shù)

參考文獻(xiàn)[7] ，將提取物分別配成100mg/mL的樣品溶液，依次取5,2.5,1.0,0.5μL點(diǎn)樣于層析硅膠鋁薄板上，然后放入層析缸，在一定極性的展開劑展開，待溶劑揮發(fā)后備用.

制備含苯酚紅(0.002%)的M-H固體培養(yǎng)基20mL，滅菌冷卻到40℃左右后加入200 μL的新鮮菌液(菌液濃度106～107cfu/mL)，搖蕩均勻無菌操作倒入已放上述層析硅膠薄板的培養(yǎng)皿，并覆蓋鋁薄板，放置20min，待其冷卻凝固后，其中一組在紫外光(320～400nm)照射1 h后，放入培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，過夜，第二天噴5mg/mL MTT水溶液觀察結(jié)果(見圖1).

2 結(jié)果與分析

10種熱帶雨林樹木提取物光活化抗微生物活性結(jié)果見表2.由表2可見，對(duì)于枯草芽孢桿菌，在紫外光(UV)照射后和黑暗(dark)中其抑菌圈直徑相差1mm有4個(gè)：布渣葉莖木正丁醇提取物(Y01-B)、白花丹根正丁醇提取物(Y04-B)、三丫苦根正丁醇提取物(Y06-B)和竹葉椒莖木石油醚提取物(Y09-P).抑菌圈直徑相差2～3mm有3個(gè)：燈臺(tái)樹去皮莖木的乙酸乙酯提取物(Y05-E)、狗花椒的石油醚和乙酸乙酯提取物(Y10-P,Y10-E).對(duì)于金黃色葡萄球菌，在紫外光照射后和黑暗中其抑菌圈的直徑相差1mm的提取物有9個(gè)：布渣葉莖木乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物(Y01-E,Y01-B)，五葉山小桔梗乙酸乙酯提取物(Y02-E)，燈臺(tái)樹去皮莖木乙酸乙酯提取物(Y05-E)，三丫苦根石油醚和乙酸乙酯提取物(Y06-P,Y06-E)，野花椒乙酸乙酯提取物(Y08-E)，竹葉椒莖木正丁醇提取物(Y09-B)和狗花椒的石油醚提取物(Y10-P).抑菌圈的直徑相差2～3mm有1個(gè)：白花丹根正丁醇的提取物(Y04-B).10種植物材料中至少有8種有光活化抗1種微生物的活性，其中布渣葉莖木(Y01)，白花丹根(Y04)，燈臺(tái)樹去皮莖木(Y05)和狗花椒(Y10) 4種植物提取物對(duì)所測(cè)試的2種微生物有光活化抗微生物的活性.綜上所述，從光活化抗微生物活性的強(qiáng)弱和范圍來分析，狗花椒(Y10)可能含有潛在的新型光敏劑，是值的進(jìn)一步研究的植物材料.

表2 九種熱帶雨林樹木提取物光活化抗微生物活性

為進(jìn)一步證明狗花椒(Y10)含有潛在的新型光敏劑，對(duì)3種蕓香科花椒屬的植物野花椒(Y08)、竹葉椒莖木(Y09)、狗花椒(Y10)按生物堿的方法提取，確定光活化抗微生物的活性部位，結(jié)果見表3.

表3 3種蕓香科植物光活化抗微生物活性

比較3種蕓香科植物光活化抗微生物活性，狗花椒(Y10)的活性最強(qiáng)，其活性部位為脂溶性生物堿，并通過狗花椒生物堿部分氯仿提取物(Y10-CA)薄層色譜自顯影技術(shù)證實(shí)了上述結(jié)果，結(jié)果見圖1.比較圖1b和圖1c，圖1b沒有抑菌現(xiàn)象，在圖1c中Rf值約為0.3，有明顯的抑菌現(xiàn)象，并隨提取物量的減少抑菌圈變小.說明Y10-CA具有光敏活性，可待進(jìn)一步分離純化.

3 結(jié)語

通過對(duì)種熱帶雨林植物的光敏抗微生物活性篩選，發(fā)現(xiàn)狗花椒(Y10)活性最強(qiáng).對(duì)3種蕓香科花椒屬的植物竹葉椒莖木(Y09)，野花椒(Y08)和狗花椒(Y10) 進(jìn)行薄層色譜自顯影，結(jié)果表明狗花椒生物堿部分氯仿提取物(Y10-CA)有明顯的光活化抗微生物活性，并隨提取物量的減少抑菌圈變小.為進(jìn)一步從該植物中快速分離活性化合物奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

a) Y10-CA(展開劑為V(環(huán)己烷)∶V(丙酮) = 7∶3，顯色劑為Dragendorff試劑)；b) Y10-CA在黑暗中抗枯草芽孢桿菌肝菌；c) Y10-CA在紫外光照射后抗枯草芽孢桿菌肝菌

參考文獻(xiàn)

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