垂穗披堿草MADS－box基因WM8克隆及分析

張妙青，張吉宇，劉志鵬，王彥榮，張磊

（草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州730020）

生殖過(guò)程是高等植物生活史中最重要的階段，也是提高植物種子產(chǎn)量的關(guān)鍵時(shí)期。因此，與植物生殖密切相關(guān)的花器官的發(fā)育和種子成熟等一直是植物學(xué)家的研究重點(diǎn)之一。近年來(lái)，通過(guò)對(duì)雙子葉模式植物擬南芥（Arabidopsisthaliana）［1］、金魚(yú)草（Antirrhinummajus）［2］等花器官的研究，初步揭示了植物花發(fā)育遺傳調(diào)控的分子機(jī)制，提出了著名的花器官發(fā)育ABC模型［3，4］，后經(jīng)進(jìn)一步深入研究逐漸發(fā)展為 ABCDE模型［5－7］。ABCDE模型中大部分基因?qū)儆贛ADS－box基因，它們編碼的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控不同基因的表達(dá)［8］。MADS－box基因具有高度保守的MADS－box結(jié)構(gòu)域和半保守的能形成卷曲螺旋的K區(qū)［9］，主要決定花器官的形成，同時(shí)參與胚珠、種皮及果實(shí)發(fā)育的調(diào)控［10－13］。在整個(gè)被子植物中，MADS－box基因的功能是保守的，大部分都參與花發(fā)育的調(diào)控［14，15］。Zhao等［16］對(duì)小麥（Triticumaestivum）42個(gè) MADS－box基因進(jìn)行了分離以及比對(duì)分析，結(jié)果表明多種MADS－box基因存在于小麥組織中，以特定模式表達(dá)，對(duì)小麥的生長(zhǎng)和發(fā)育可能起重要的作用。對(duì)水稻（Oryza sativa）75個(gè)MADS－box基因的研究表明，31個(gè)基因在水稻生殖階段優(yōu)先積累，其中12個(gè)在種子、6個(gè)在穗部特定表達(dá)［17］。有關(guān)禾本科牧草相關(guān)基因的研究較少。Preston和Kellogg［18］重建了禾本科植物MADS－box轉(zhuǎn)錄因子FUL1和FUL2的進(jìn)化史，并確定了其APETALA1／FRUITFULL－like基因序列和表達(dá)的演化。

垂穗披堿草（Elymusnutans）是禾本科（Gramineae）小麥族（Triticeae）披堿草屬（Elymus）的多年生根莖疏叢型優(yōu)質(zhì)牧草，其抗寒能力強(qiáng)、粗蛋白含量高且適口性好［19，20］。主要分布在歐亞大陸和北美洲北部，垂直分布從海拔幾米的海灘一直到海拔5 200m以上的喜馬拉雅山區(qū)，我國(guó)西藏以及西北、華北等地區(qū)均有野生分布，是草原和草甸的重要組成部分［21］。我國(guó)西北高寒、濕潤(rùn)地區(qū)，垂穗披堿草栽培較多，主要用于建植人工草地和放牧草地。近年來(lái)，對(duì)垂穗披堿草的種子產(chǎn)量、遺傳多樣性以及栽培放牧等方面的研究較多［22－25］，而關(guān)于MADS－box基因的研究多集中在擬南芥、金魚(yú)草等模式植物以及水稻、小麥等農(nóng)作物中，很少涉及到草類(lèi)植物，垂穗披堿草中的MADS－box基因尚未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)垂穗披堿草中MADS－box基因的研究，不僅有助于闡明其控制花發(fā)育的分子機(jī)制，具有潛在的種子生產(chǎn)價(jià)值，而且作為麥類(lèi)作物的野生近緣種遺傳資源，對(duì)于豐富麥類(lèi)作物基因資源庫(kù)具有重要的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值［26］。

1 材料與方法

1.1 材料

垂穗披堿草種子于2008年采自甘肅甘南草原，采集后保存在農(nóng)業(yè)部牧草與草坪草種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（蘭州）低溫種子庫(kù)。2009年在蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院盆栽，苗期采集幼嫩葉片，用液氮處理，然后置于－80℃ 超低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

PrimeScriptTMRT－PCR Kit（TaKaRa），RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN），DNA Marker，DNA 凝膠回收試劑盒，DH5α感受態(tài)細(xì)胞，pGM－T克隆試劑盒購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司。引物由北京賽百盛生物工程公司合成，其他試劑采用國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 總 RNA 的提取 參照 RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）使用說(shuō)明，提取垂穗披堿草幼嫩葉片的總RNA，用紫外分光光度計(jì)Nanodrop進(jìn)行RNA純度測(cè)定，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA完整性。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 檢索 National Center for Biotechnology Information（簡(jiǎn)稱(chēng) NCBI）上已公布的與垂穗披堿草近緣種的WM8及其同源基因的蛋白序列，多序列比對(duì)找出高度同源區(qū)域，用Primer Premier 5.0進(jìn)行簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)，從垂穗披堿草擴(kuò)增該基因的核心片段。上游引物為P1：5′ARWSNGARGGNAAYTGGT 3′，下游引物為P2：5′RCANACRTTYTGYTGNGG 3′，預(yù)測(cè)片段長(zhǎng)度為449bp。

用獲得的該基因核心序列在NCBI上Blast，取相似性最高的全長(zhǎng)序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，上游引物為P3：5′GCATCCCATCTCCCCTCACCG 3′，下游引物為P4：5′TAAGCCAAGCAGGTCATCCATGCTA 3′，以從垂穗披堿草擴(kuò)增該基因的全長(zhǎng)片段，預(yù)測(cè)片段長(zhǎng)度為1 194bp。

1.2.3 cDNA第一條鏈的合成 參照PrimeScriptTMRT－PCR Kit（TaKaRa）使用說(shuō)明，取2μL垂穗披堿草葉片總RNA，以O(shè)ligo dT為引物，進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成。第1步反應(yīng)體系為10μL：dNTP Mixture（10 mmol／L each），1μL；Oligo（dT）Primer（2.5μmol／L），1μL；總 RNA 2μL；Rnase Free dH2O至10μL。反應(yīng)為65℃5min。第2步反應(yīng)體系為20μL：上述反應(yīng)產(chǎn)物，10μL；5×PrimeScriptTMBuffer，4μL；Rnase Inhibitor（40 U／μL），0.5μL；PrimeScriptTMRTase（for 2step），0.5μL；Rnase Free dH2O 至20μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為42℃30 min，95℃5min。

1.2.4 cDNA核心序列的PCR擴(kuò)增 以合成的cDNA第一鏈產(chǎn)物為模板，參照PrimeScriptTMRT－PCR Kit（TaKaRa）使用說(shuō)明，PCR反應(yīng)體系50μL：10×PCR Buffer，5μL；dNTP Mixture（10mmol／L），2μL；Ex Taq HS（5U／μL），0.5μL；引物P1和P2，各2μL；反轉(zhuǎn)錄的總cDNA 1μL；ddH2O補(bǔ)至50μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性1min，然后以94℃30s，45℃30s，72℃1min進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.5 全長(zhǎng)序列的PCR擴(kuò)增 以合成的cDNA第一鏈產(chǎn)物為模板，參照 PrimeScriptTMRT－PCR Kit（TaKa－Ra）使用說(shuō)明，PCR反應(yīng)體系50μL：10×PCR Buffer，5μL；dNTP Mixture（10mmol／L），2μL；Ex Taq HS（5 U／μL），0.5μL；引物P3和P4，各1μL；反轉(zhuǎn)錄的總cDNA，1μL；ddH2O補(bǔ)至50μL。反應(yīng)程序：94℃ 預(yù)變性1 min，然后以94℃30s，58℃30s，72℃1min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.6 測(cè)序、生物信息學(xué)分析以及蛋白結(jié)構(gòu)分析 PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收后連接在pGM－T載體上，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，Luria－Bertani（簡(jiǎn)稱(chēng)LB）固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，藍(lán)白斑篩選挑取陽(yáng)性克隆，通過(guò)PCR鑒定后送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

通過(guò) NCBI（http：／／blast.ncbi.Nlm.nih.gov／Blast.cgi）網(wǎng)站進(jìn)行 Blast檢索，利用 DNAMAN 6.0和Sequencher 4.9Demo生物技術(shù)軟件進(jìn)行序列翻譯、多重比對(duì)以及同源樹(shù)等分析。

蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)利用 ProtParam（http：／／us.expasy.org／cgi－bin／protparam）進(jìn)行分析，包括氨基酸殘基數(shù)目、氨基酸組成、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)以及疏水性等參數(shù)；利用TMHMM 2.0Serve（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM）和 TMpred（http：／／www.ch.embnet.org／software／TMPRED）2個(gè)軟件同時(shí)對(duì)該蛋白序列的跨膜區(qū)域進(jìn)行分析；用 PSORT WWW Server（http：／／psort.nibb.ac.jp／）中的 PSORT Prediction工具進(jìn)行細(xì)胞定位。利用 NPSA（http：／／npsa－pbil.ibcp.fr／）中的 MLRC程序在線分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈等結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。通過(guò)Expasy（http：／／au.expasy.org／tools／）網(wǎng)站中Swiss－Model程序進(jìn)行同源建模，推測(cè)垂穗披堿草WM8蛋白的三維結(jié)構(gòu)。

圖1 垂穗披堿草總RNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Electrophoresis result of total RNA fromE.nutans

2 結(jié)果與分析

2.1 垂穗披堿草WM8基因全長(zhǎng)序列的PCR擴(kuò)增

用 RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）提取的垂穗披堿草葉片的總RNA（圖1），RNA 28S與18S條帶明顯，效果理想，滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)所需。

利用提取的總 RNA，PrimeScriptTMRT－PCR Kit（TaKaRa），以 Oligo（dT）為引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄所得的產(chǎn)物為模板，以設(shè)計(jì)的引物P1、P2進(jìn)行垂穗披堿草WM8基因核心片段的PCR擴(kuò)增，獲得了與預(yù)期大小相符的條帶（圖2），經(jīng)測(cè)序確認(rèn)，片段長(zhǎng)度為443bp。以引物P3、P4，進(jìn)行其全長(zhǎng)序列的PCR擴(kuò)增，獲得了與預(yù)期大小相符的特異條帶（圖3），經(jīng)測(cè)序確認(rèn)，片段長(zhǎng)度為1 196bp。由于所設(shè)計(jì)引物為同源比對(duì)保守區(qū)域，PCR擴(kuò)增結(jié)果較為特異，大小亦與預(yù)期結(jié)果相符，雖有部分非特異性擴(kuò)增條帶，但其濃度、大小均不符。

圖2 EnWM8基因cDNA核心序列電泳分析Fig.2 Electrophoresis of EnWM8gene cDNA core sequence fromE.nutans

圖3 EnWM8基因cDNA全長(zhǎng)序列電泳分析Fig.3 Electrophoresis of EnWM8gene cDNA full length sequence fromE.nutans

2.2 EnWM8基因全序列分析

對(duì)分離得到的基因片段進(jìn)行測(cè)序，獲得了一段完整的cDNA序列，全長(zhǎng)1 196bp，其中包含一段828bp的開(kāi)放閱讀框，編碼275個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，具有典型的植物MADS－box基因的結(jié)構(gòu)［8］。將此片段命名為En－WM8，在GenBank注冊(cè)，登錄號(hào)為JF683846。

從結(jié)構(gòu)上可將EnWM8基因推導(dǎo)的氨基酸序列分成4個(gè)區(qū)（圖4），第1～61個(gè)氨基酸為高保守的MADS－box結(jié)構(gòu)區(qū)域，是識(shí)別DNA順式作用元件并與之結(jié)合的一段氨基酸序列；第75～174個(gè)氨基酸為半保守的K區(qū)；位于MADS－box區(qū)和K區(qū)之間的部分為I區(qū)，是MADS－box區(qū)和K區(qū)的銜接部分；K區(qū)的下游為極不保守的C－末端。

將獲得的cDNA序列在NCBI上進(jìn)行BLASTX比較，其編碼的蛋白質(zhì)與其他多種植物MADS－box基因蛋白具有很高的同源性，其中與小麥的WM8（90%）、AGL29（95%）和大麥的MADS8（93%）相似性最高。En－WM8與二倍體小麥（T.aestivum）的TaWM8、TaAGL29、六倍體小麥（T.monococcum）的fruitful－like基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，相似性分別高達(dá)95.62%（262／274），96.72%（265／274）和96.28%（181／188）（圖5）。

EnWM8與小麥的50MADS基因、擬南芥的AtWM8及AtAGL29基因編碼的蛋白質(zhì)序列經(jīng)由DNAMAN軟件推演的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，不同組的基因被分到不同的分支，EnWM8屬于MIKC型MADS－box基因，與TaWM8進(jìn)化關(guān)系最近，其次依次是TaAGL29、TaVRT－1、TaAGL10，與擬南芥的TaWM8、TaGL29進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)（圖6）。

圖4 EnWM8基因cDNA核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列Fig.4 Nucleotide sequences and deduced amino acid sequences for EnWM8gene cDNA fromE.nutans

圖5 垂穗披堿草的EnWM8與小麥的WM8、AGL29、fruitful－like基因氨基酸序列比對(duì)Fig.5 The comparison of the deduced amino acid sequences between EnWM8of E.nutans，WM8and AGL29of T.aestivum，fruitful－like of T.monococcum

2.3 垂穗披堿草WM8蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 垂穗披堿草 WM8蛋白氨基酸序列分析 垂穗披堿草 WM8蛋白由275個(gè)氨基酸組成，分子量為13 726.7Da，理論等電點(diǎn)為9.14，是一個(gè)堿性蛋白。對(duì)其氨基酸組成的分析結(jié)果表明，該蛋白分子式為C1353H2192N412O427S14，原子總數(shù)為4 398。堿性氨基酸殘基總數(shù)（Arg＋Lys）為38，酸性氨基酸殘基總數(shù)（Asp＋Glu）為31。

2.3.2 垂穗披堿草WM8蛋白疏水性和跨膜分析以及細(xì)胞定位 垂穗披堿草WM8氨基酸序列疏水性分析表明，該蛋白的氨基酸中大部分為親水性氨基酸，疏水性的總平均值（GRAVY）為－0.935，所以該蛋白為親水性蛋白（圖7）。

利用TMHMM 2.0Server和TMpred對(duì)該蛋白跨膜區(qū)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明跨膜區(qū)域?yàn)??？缒^(qū)域中氨基酸序列的期望值大于18時(shí)，蛋白才有跨膜區(qū)域。該蛋白在跨膜區(qū)域中的氨基酸序列期望值僅為0.013 26。因此，垂穗披堿草WM8蛋白沒(méi)有跨膜區(qū)域。

通過(guò)PSORT WWW Server中的工具PSORT Prediction，對(duì)垂穗披堿草 WM8蛋白進(jìn)行細(xì)胞定位顯示，該蛋白存在于細(xì)胞核（nucleus）中的可能性為76.0%，存在于過(guò)氧化物酶體（microbody peroxisome）、線粒體雜基空間（mitochondrial matrix space）和葉綠體類(lèi)囊體膜（chloroplast thylakoid membrane）中的可能性較小，分別為30%，10%和10%。該蛋白是否存在于細(xì)胞壁膜間隙、外膜及內(nèi)膜等都無(wú)法確定。

圖6 EnWM8與小麥50個(gè)MADS基因、AtWM8和AtAGL29序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.6 Analysis of the phylogentic relationship among the deduced amino acid sequences of EnWM8，50MADS genes of T.aestivum，AtWM8and AtAGL29

2.3.3 垂穗披堿草 WM8蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過(guò) NPSA（http：／／npsa－pbil.ibcp.fr／）對(duì)垂穗披堿草WM8蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖8），分析預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，垂穗披堿草WM8蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中主要為α－螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈，所占比例分別為52.36%，37.82%和9.82%。可見(jiàn)，α－螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈構(gòu)成了其二級(jí)結(jié)構(gòu)的重要部分。

通過(guò)Expasy（http：／／au.expasy.org／tools／）網(wǎng)站中SwissModel程序?qū)Υ顾肱麎A草 WM8蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果表明（圖9），該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中主要為α－螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈，所占比例依次為α－螺旋最多，無(wú)規(guī)則卷曲次之，延伸鏈最少，無(wú)β－折疊存在。這與通過(guò) NPSA（http：／／npsa－pbil.ibcp.fr／）對(duì)該蛋白進(jìn)行的二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖7 垂穗披堿草WM8蛋白的疏水性分析Fig.7 The hydrophobicity analysis of WM8protein fromE.nutans

圖8 垂穗披堿草WM8蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.8 The secondary structure prediction of WM8protein fromE.nutans

圖9 垂穗披堿草WM8蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.9 The three－dimensional structure prediction of WM8protein fromE.nutans

3 討論

本研究根據(jù)MADS區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并性引物，利用RT－PCR的方法獲得EnWM8基因cDNA片段，然后利用與NCBI上已公布的WM8及其同源基因的序列進(jìn)行比對(duì)，選取與其相似性最高的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)RT－PCR的方法克隆獲得了一段完整的cDNA序列，全長(zhǎng)1 196bp，其中包含一段828bp的開(kāi)放閱讀框，編碼275個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，具有典型的高保守的MADS－box結(jié)構(gòu)域以及半保守的K區(qū)，說(shuō)明EnWM8是典型的MADS－box基因。

EnWM8推導(dǎo)的氨基酸序列與小麥的WM8、AGL29和fruitful－like相似性較高，分別為95.62%，96.72%和96.28%，且與小麥的50個(gè) MADS－box基因、擬南芥的AtWM8及AtAGL29基因編碼的蛋白質(zhì)序列經(jīng)由DNAMAN軟件推演的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示結(jié)果與其相符，同時(shí)也說(shuō)明了垂穗披堿草與小麥親緣關(guān)系較近，而與擬南芥親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。另外，推演系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)時(shí)還發(fā)現(xiàn)MADS－box基因5′端均高度保守，而3′末端變異較大，這也驗(yàn)證了MADS－box基因家族典型的MADS－box結(jié)構(gòu)域的存在。單子葉植物和雙子葉植物兩者花器官形態(tài)雖有所不同，但其各輪花器官亦可基本對(duì)應(yīng)。就垂穗披堿草和擬南芥而言，水稻中的內(nèi)外稃、漿片、雄蕊和心皮分別對(duì)應(yīng)擬南芥中的萼片、花瓣、雄蕊和心皮，且MADS－box基因在單子葉植物和雙子葉植物中在結(jié)構(gòu)和功能上都具有相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦裕?4，27］。按系統(tǒng)進(jìn)化分析，EnWM8屬于 MIKC型 MADS－box基因，且與小麥的WM8、AGL29和fruitful－like氨基酸序列相似性較高（均大于95%）。擬南芥中AGL29基因是控制花粉成熟及其競(jìng)爭(zhēng)能力的下游調(diào)控因子［28］，而fruitful－like基因既在花發(fā)育早期促進(jìn)花序分生組織的形成，又在花發(fā)育的晚期影響心皮的形成及角果的開(kāi)裂，同時(shí)還影響葉片的發(fā)育［29］。據(jù)此推測(cè)WM8基因與它們的功能相似。然而，關(guān)于MADS－box基因WM8的研究很少，僅在擬南芥、小麥等植物中少有報(bào)道［15］，其具體基因功能更是未明，有待于進(jìn)一步研究。

利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)垂穗披堿草WM8蛋白的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，主肽鏈由275個(gè)氨基酸組成，理論等電點(diǎn)為9.14，蛋白分子量為31 511.7Da，分子式為C1353H2192N412O427S14，是一個(gè)堿性蛋白。蛋白質(zhì)疏水性預(yù)測(cè)中，GRAVY值的范圍是－2～2，正值表明該蛋白為疏水性蛋白，負(fù)值表明為親水性蛋白。利用ProtParam工具統(tǒng)計(jì)的GRAVY為－0.935，所以垂穗披堿草WM8蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)。對(duì)垂穗披堿草WM8蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白可以形成α－螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈，所占比例分別為52.36%，37.82%和9.82%。不同的氨基酸，對(duì)于形成不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)有著不同的能力。異亮氨酸、纈氨酸及蘇氨酸等有分枝的氨基酸，通常采用β－折疊的形態(tài)。脯氨酸對(duì)于α－螺旋的穩(wěn)定性有一定的破壞能力。而在垂穗披堿草WM8蛋白中，這些氨基酸的含量較少，因此形成β－折疊的可能性也較小，這可能是相當(dāng)比例的無(wú)規(guī)則卷曲出現(xiàn)的原因。該蛋白堿性氨基酸含量大于酸性氨基酸含量，因此其等電點(diǎn)較高（pI為9.14）。垂穗披堿草WM8蛋白通過(guò)生物信息軟件分析，沒(méi)有N端信號(hào)肽，也沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)，因此可以預(yù)測(cè)該蛋白可能定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。通過(guò)PSORT WWW Server中的工具PSORT Prediction對(duì)垂穗披堿草WM8蛋白進(jìn)行細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，該蛋白存在于細(xì)胞核中的可能性為76.0%，與上述預(yù)測(cè)一致。對(duì)該蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析可知，該蛋白富含α－螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，因此，該蛋白的主要功能很可能由這些結(jié)構(gòu)承載。

總之，本研究從垂穗披堿草中分離獲得了EnWM8基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并進(jìn)行了系統(tǒng)的序列分析以及蛋白結(jié)構(gòu)分析，不僅為進(jìn)一步研究EnWM8基因在垂穗披堿草中的表達(dá)分析、功能驗(yàn)證、蛋白的分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系等奠定了基礎(chǔ)，且可為深入研究垂穗披堿草的花發(fā)育、種子成熟等機(jī)制提供參考。

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