TRB3沉默對(duì)氧糖剝奪/再灌注誘導(dǎo)的大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的影響

徐汪洋，王業(yè)楊，張輝，黃麗珊

廣東省第二人民醫(yī)院骨科中心，廣州 515000

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種破壞性的創(chuàng)傷[1]，可導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損[2]、癱瘓，甚至死亡[3]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一類重要的膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元非常重要[4-5]，成為近年來(lái)SCI修復(fù)的研究熱點(diǎn)[6]。Tribbles同源蛋白3(Tribbles homologue 3，TRB3)是一種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡，與機(jī)體炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和腫瘤代謝等多種過(guò)程密切相關(guān)[7]。研究發(fā)現(xiàn)，TRB3表達(dá)下調(diào)對(duì)全腦缺血再灌注損傷所致大鼠神經(jīng)元凋亡具有保護(hù)作用[8-9]，但目前其對(duì)SCI的作用研究較少。本研究旨在探討TRB3對(duì)氧糖剝奪/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)誘導(dǎo)的大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的影響，以為治療SCI引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷及多種炎癥反應(yīng)提供靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 D M E M/F 1 2 培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；TRB3 shRNA慢病毒(上海GenePharma公司)；CCK-8試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；乳酸脫氫酶(l a c t i c dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1，IL-1β) ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；Annexin V-FITC/PI試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；Trizol試劑、Revert Aid第一鏈cDNA synthesis反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑、PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)；細(xì)胞核蛋白提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；抗TRB3抗體、抗核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)抗體、抗β-actin兔克隆抗體、抗GFAP抗體(英國(guó)Abcam公司)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；白樺脂酸(betulinic acid，BA) (美國(guó)MedChemExpress公司)。

1.2 大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定 新生SD雄性大鼠20只，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(粵)2013-0011]。本研究通過(guò)廣東省第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(20200622-GZSKJ-14)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合國(guó)家和單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和使用規(guī)定。參照Liu等[10]的方法，從新生2 d的SD大鼠中分離培養(yǎng)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞。無(wú)菌條件下剖開(kāi)大鼠椎管，小心剝離脊膜和血管，分離出脊髓組織，剪成細(xì)小碎塊，加入0.125%胰蛋白酶反復(fù)消化，然后加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾后制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞以1×105個(gè)/cm2密度接種于培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每2 d換液1次，至第9天細(xì)胞基本融合成片，換液后于37 ℃搖床上240 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，棄上清(主要是小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞)，每2 d振蕩1次，重復(fù)2次。收集貼壁細(xì)胞，PBS洗滌，加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1 d，經(jīng)胰蛋白酶消化傳代，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，采用GFAP免疫熒光法進(jìn)行鑒定，純度超過(guò)90%可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 GFAP免疫熒光法鑒定大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞 分離培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片，培養(yǎng)24 h，棄掉培養(yǎng)液，PBS洗滌1次；用4%多聚甲醛溶液固定20 min，PBS洗滌3次；用5% BSA室溫下封閉2 h，加入GFAP一抗(1:500)4 ℃孵育過(guò)夜；次日PBS洗滌3次，滴加FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(1:200)室溫孵育2 h；洗滌后加入DAPI室溫孵育20 min，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。洗滌后于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 TRB3 shRNA慢病毒感染細(xì)胞及分組 將脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞分為對(duì)照組(不做任何處理)、Scramble組(感染陰性對(duì)照慢病毒)與shTRB3組(感染TRB3 shRNA慢病毒)。將細(xì)胞于6孔板中培養(yǎng)，待融合度達(dá)50%時(shí)，根據(jù)慢病毒使用說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行感染，步驟如下：吸出孔內(nèi)培養(yǎng)基，添加感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為20的慢病毒，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。次日更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞總RNA及總蛋白，采用Real-time PCR及Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞中TRB3 mRNA及蛋白水平，確定TRB3 shRNA慢病毒干擾效率。

1.5 OGD/R細(xì)胞模型建立及分組 參照Sun等[11]的方法建立脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R模型。細(xì)胞用PBS洗滌后，于1% O2、5% CO2、37 ℃無(wú)糖DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h，然后于正常條件下在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

將細(xì)胞分為對(duì)照組(正常培養(yǎng))、OGD/R組(進(jìn)行OGD/R處理)、shTRB3組(感染TRB3 shRNA慢病毒)、Scramble組(感染陰性對(duì)照慢病毒)、OGD/R+shTRB3組(感染TRB3 shRNA慢病毒后，進(jìn)行OGD/R處理)與OGD/R+Scramble組(感染陰性對(duì)照慢病毒后，進(jìn)行OGD/R處理)。對(duì)于BA處理實(shí)驗(yàn)，OGD/R組和OGD/R+shTRB3組細(xì)胞在1% O2、5%CO2、37 ℃的無(wú)糖DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h后，加入20 μmol/L BA繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 收集各組細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/ml，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入300 μl結(jié)合緩沖液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟按順序加入Annexin-V及PI，室溫避光孵育5 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.5.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 將脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞接種于96孔板(1×105個(gè)/ml)中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照上述分組進(jìn)行相應(yīng)處理后，每孔加入10 μl CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(OD)，每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.5.3 細(xì)胞培養(yǎng)液LDH漏出率測(cè)定 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清及細(xì)胞裂解物，用LDH活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組OD值，具體參照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，重復(fù)3次。細(xì)胞培養(yǎng)液LDH漏出率(%)=培養(yǎng)液OD值/(培養(yǎng)液OD值+細(xì)胞勻漿液OD值)×100%。

1.5.4 SOD活性、MDA含量測(cè)定 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，分別用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法檢測(cè)SOD活性和MDA含量，按照SOD、MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作。

1.5.5 ELISA法檢測(cè)炎性因子IL-1β和TNF-α水平收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，用ELISA試劑盒檢測(cè)炎性因子IL-1β和TNF-α的分泌量，具體按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，重復(fù)3次。

1.5.6 Real-time PCR檢測(cè)TRB3 mRNA相對(duì)表達(dá)量用Trizol提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，按照Revert Aid第一鏈cDNA synthesis反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作。反應(yīng)條件：90 ℃ 10 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算TRB3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列如下：TRB3上游5'-TCCGTAGAGGGACCTTTGCC-3'，下游5'-CCTCAACCAGGGATGTAGCAG-3'；GAPDH上游5'-AGGTCGGTGTCAACGGATTT-3'，下游5'-CAGCATCAAAGGTGGAGGAA-3'。

1.5.7 Western blotting檢測(cè)TRB3、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，PBS洗滌后，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。對(duì)于細(xì)胞核NF-κB p65的檢測(cè)，使用核蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞核蛋白，并測(cè)定濃度。取20 μg總蛋白行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入相應(yīng)一抗孵育。對(duì)于TRB3 shRNA慢病毒感染效率的檢測(cè)，使用抗TRB3抗體(1:1000)孵育；對(duì)于細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路的檢測(cè)，使用抗NF-κB p65抗體(1:500)孵育。洗膜后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1:5000)孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，ImageJ軟件測(cè)定灰度值，以β-actin為內(nèi)參，分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定 光鏡下觀察顯示，培養(yǎng)3 d時(shí)，脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞主要呈梭形或星形，形狀多不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核大(圖1)。隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞和總細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞率達(dá)95%以上，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 純化培養(yǎng)的大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP熒光染色Fig.1 Purified and cultured astrocytes in rat spinal cord(GFAP fluorescence staining)

2.2 OGD/R處理對(duì)大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞中TRB3表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，OGD/R組星形膠質(zhì)細(xì)胞中TRB3 mRNA(2.15±0.12vs. 1.00±0.05)和蛋白(2.10±0.16vs. 1.00±0.08)表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2 OGD/R處理后大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞中TRB3 mRNA和蛋白表達(dá)情況(n=3)Fig.2 The mRNA and protein expression levels of TRB3 in rat spinal astrocytes after OGD/R treatment (n=3)

2.3 TRB3沉默對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響 為進(jìn)一步研究TRB3的作用，使用TRB3 shRNA慢病毒感染星形膠質(zhì)細(xì)胞，并對(duì)TRB3 shRNA慢病毒干擾效率進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Scramble組星形膠質(zhì)細(xì)胞中TRB3 mRNA和蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，shTRB3組星形膠質(zhì)細(xì)胞中TRB3 mRNA(0.30±0.07vs.1.00±0.10)和蛋白(0.30±0.04vs. 1.00±0.06)表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3A、B)，表明TRB3 shRNA慢病毒感染成功。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示， 與對(duì)照組(2.4%±0.2%)比較，Scramble組(3.2%±0.4%)和shTRB3組(3.5%±0.5%)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，OGD/R組(24.9%±1.1%)、OGD/R+Scramble組(24.8%±1.5%)和OGD/R+shTRB3組(13.4%±0.2%)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而OGD/R+shTRB3組星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率明顯低于OGD/R組和OGD/R+Scramble組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3C)。

圖3 TRB3沉默對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響(n=3)Fig.3 Effects of TRB3 silencing on the OGD/R-induced apoptosis in rat spinal astrocytes (n=3)

2.4 TRB3沉默對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活性、LDH漏出率、MDA含量及SOD活性的影響 與對(duì)照組比較，Scramble組和shTRB3組細(xì)胞活性、LDH漏出率、MDA含量、SOD活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，OGD/R組、OGD/R+Scramble組和OGD/R+shTRB3組細(xì)胞活性、SOD活性明顯降低，LDH漏出率、MDA含量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與OGD/R組和OGD/R+Scramble組比較，OGD/R+shTRB3組細(xì)胞活性、SOD活性明顯升高，LDH漏出率、MDA含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 TRB3沉默對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活性、LDH漏出率、MDA含量及SOD活性的影響(±s，n=6)Tab.1 Effects of TRB3 silencing on cell viability and LDH leakage rate, SOD activity and MDA content in OGD/R-induced rat spinal astrocytes (±s, n=6)

TRB3. Tribbles同源蛋白3；OGD/R. 氧糖剝奪/再灌注；LDH. 乳酸脫氫酶；MDA. 丙二醛；SOD. 超氧化物歧化酶；與對(duì)照組比較，(1)P<0.05；與Scramble組比較，(2)P<0.05；與shTRB3組比較，(3)P<0.05；與OGD/R組比較，(4)P<0.05；與OGD/R+Scramble組比較，(5)P<0.05。

組別細(xì)胞活性(%)LDH漏出率(%)MDA含量(nmol/ml)SOD活性(ng/ml)對(duì)照組100.0±6.216.53±0.602.15±0.172.97±0.11 Scramble組99.0±3.617.50±0.362.56±0.263.07±0.02 shTRB3組109.0±3.018.80±0.532.51±0.163.19±0.10 OGD/R組47.0±6.6(1)(2)(3)43.17±2.20(1)(2)(3)5.49±0.167(1)(2)(3)1.42±0.12(1)(2)(3)OGD/R+Scramble組49.0±5.6(1)(2)(3)47.13±1.50(1)(2)(3)5.57±0.15(1)(2)(3)1.44±0.09(1)(2)(3)OGD/R+shTRB3組82.7±6.1(1)(2)(3)(4)(5)25.63±1.05(1)(2)(3)(4)(5)3.44±0.23(1)(2)(3)(4)(5)2.25±0.19(1)(2)(3)(4)(5)F 76.28371.5190.8144.4 P<0.001<0.001<0.001<0.001

2.5 TRB3沉默對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α、IL-1β水平的影響 與對(duì)照組比較，Scramble組和shTRB3組星形膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α、IL-1β水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，OGD/R組、OGD/R+Scramble組和OGD/R+shTRB3組星形膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α、IL-1β水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與OGD/R組和OGD/R+Scramble組比較，OGD/R+shTRB3組星形膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α、IL-1β水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 TRB3沉默對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α和IL-1β水平的影響(ng/ml，±s，n=6)Tab.2 Effects of TRB3 silencing on the TNF-α and IL-1β levels in OGD/R-induced rat spinal astrocytes (ng/ml, ±s,n=6)

表2 TRB3沉默對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α和IL-1β水平的影響(ng/ml，±s，n=6)Tab.2 Effects of TRB3 silencing on the TNF-α and IL-1β levels in OGD/R-induced rat spinal astrocytes (ng/ml, ±s,n=6)

TRB3. Tribbles同源蛋白3；OGD/R. 氧糖剝奪/再灌注；TNF-α. 腫瘤壞死因子-α；IL-1β. 白細(xì)胞介素-1β；與對(duì)照組比較，(1)P<0.05；與Scramble組比較，(2)P<0.05；與shTRB3組比較，(3)P<0.05；與OGD/R組比較，(4)P<0.05；與OGD/R+Scramble組比較，(5)P<0.05。

組別TNF-αIL-1β對(duì)照組0.24±0.010.13±0.01 Scramble組0.24±0.020.14±0.00 shTRB3組0.27±0.010.15±0.01 OGD/R組0.42±0.02(1)(2)(3)0.31±0.02(1)(2)(3)OGD/R+Scramble組 0.43±0.02(1)(2)(3)0.32±0.01(1)(2)(3)OGD/R+shTRB3組 0.31±0.03(1)(2)(3)(4)(5) 0.22±0.02(1)(2)(3)(4)(5)F 71.86115.10 P<0.001<0.001

2.6 NF-κB p65參與TRB3沉默對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié) 為進(jìn)一步研究TRB3調(diào)節(jié)OGD/R誘導(dǎo)的大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，對(duì)NF-κB信號(hào)通路進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，各組星形膠質(zhì)細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)總NF-κB p65蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組和Scramble組比較，shTRB3組星形膠質(zhì)細(xì)胞中細(xì)胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與shTRB3組比較，OGD/R處理明顯提高星形膠質(zhì)細(xì)胞中細(xì)胞核NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與OGD/R組和OGD/R+Scramble組比較，OGD/R+shTRB3組星形膠質(zhì)細(xì)胞中細(xì)胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4A)。進(jìn)一步使用NF-κB激動(dòng)劑BA處理OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞，結(jié)果顯示，與OGD/R組比較，BA處理能明顯提高細(xì)胞凋亡率(36.15%±0.87%vs. 24.70%±1.05%，P<0.05)；與OGD/R+shTRB3組比較，BA處理能逆轉(zhuǎn)TRB3 shRNA慢病毒感染對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用(13.91%±1.20%vs. 22.00%±1.04%，P<0.05，圖4B)。

圖4 NF-κB p65參與TRB3沉默對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)(n=3)Fig.4 NF-κB p65 participates in the regulation of TRB3 silencing on OGD/R induced rat spinal astrocytes apoptosis (n=3)

3 討 論

SCI可造成嚴(yán)重的神經(jīng)損傷，并可進(jìn)一步導(dǎo)致認(rèn)知功能喪失、肢體運(yùn)動(dòng)障礙甚至癱瘓，給患者帶來(lái)巨大的痛苦[12]。氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡在SCI的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[13]。TRB3是Tribbles同源蛋白家族成員之一，而TRB3基因?qū)儆趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)基因，多種應(yīng)激條件如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)不足及氧化應(yīng)激等均能調(diào)控其在細(xì)胞中的表達(dá)[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，TRB3可激活I(lǐng)L-6，使細(xì)胞抵抗棕櫚酸鹽誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。而TRB3表達(dá)下調(diào)可阻止細(xì)胞因子誘導(dǎo)的Bcl-2相關(guān)X蛋白(BAX)的構(gòu)型變化，抑制細(xì)胞凋亡。在全腦缺血再灌注大鼠中，TRB3表達(dá)下調(diào)可抑制全腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡[9]。本研究建立OGD/R星形膠質(zhì)細(xì)胞模型，模擬體內(nèi)脊髓缺血再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的病理變化，發(fā)現(xiàn)TRB3在大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R模型中表達(dá)增加，提示TRB3可能在星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用；采用TRB3 shRNA慢病毒感染細(xì)胞沉默TRB3的表達(dá)，進(jìn)一步確定TRB3沉默可明顯提高OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性和細(xì)胞中SOD的活性，抑制LDH漏出，減少M(fèi)DA的生成，從而減輕OGD/R對(duì)細(xì)胞的損傷。MDA和SOD是目前公認(rèn)的SCI后能反映氧自由基水平的指標(biāo)[16]，前者為脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，后者為細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化酶。發(fā)生SCI后，減少M(fèi)DA的生成、提高SOD的活性可減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及抑制自由基的釋放，從而減輕脊髓受到的繼發(fā)性損傷，為損傷脊髓的修復(fù)創(chuàng)造較好的環(huán)境[17]。

SCI可引起神經(jīng)元凋亡增加，并可通過(guò)多種調(diào)節(jié)途徑加重繼發(fā)性SCI，導(dǎo)致不可逆的脊髓功能障礙[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R誘導(dǎo)大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后，細(xì)胞凋亡增加，而TRB3沉默可明顯抑制OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。TRB3是C/EBP同源蛋白(CHOP)的靶標(biāo)之一，也是CHOP的調(diào)控因子，可通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制嚴(yán)格調(diào)控CHOP信號(hào)通路。正常生理?xiàng)l件下，TRB3是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的傳感器。由短暫、溫和的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)表達(dá)的TRB3，可通過(guò)結(jié)合CHOP和激活轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)阻斷其功能。但長(zhǎng)期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的TRB3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15,19-20]。SCI后，持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)TRB3高表達(dá)，而過(guò)量的TRB3最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡增加，提示TRB3可能是應(yīng)激依賴性細(xì)胞死亡疾病的潛在治療靶點(diǎn)。然而，目前尚無(wú)商品化的TRB3小分子抑制劑。

炎癥是SCI后繼發(fā)性SCI的關(guān)鍵機(jī)制[21]，主要是由損傷部位的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌損傷相關(guān)分子引起的[22]。星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的炎性因子如TNF-α和IL-1β等大量積聚并侵入SCI部位，可導(dǎo)致繼發(fā)性炎癥，從而加重SCI[23-24]?？刂撇p輕SCI后發(fā)生的炎癥反應(yīng)能夠減輕SCI。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R處理后，星形膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α和IL-1β分泌增多，而TRB3沉默能夠抑制OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-1β的分泌，這可能有助于SCI后大鼠的功能恢復(fù)。

NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在SCI后發(fā)生的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、局部缺血再灌注及細(xì)胞凋亡等過(guò)程中起著重要作用[23,25]。NF-κB的細(xì)胞核易位及p65亞基的磷酸化對(duì)下游基因的激活至關(guān)重要。SCI后，NF-κB過(guò)度活化并迅速入核，調(diào)控靶基因引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重SCI[26-27]。最近研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB p65參與了TRB3的調(diào)節(jié)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R處理后細(xì)胞核NF-κB p65表達(dá)水平升高，而TRB3沉默可抑制OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞核NF-κB p65水平升高。進(jìn)一步使用NF-κB激動(dòng)劑BA處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)BA能逆轉(zhuǎn)TRB3沉默對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用，提示TRB3沉默可能通過(guò)抑制NF-κB通路活化而減輕脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，TRB3沉默能夠減輕OGD/R誘導(dǎo)的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷，該結(jié)果為SCI后修復(fù)提供了理論依據(jù)。但本研究為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，后續(xù)研究需要進(jìn)一步使用脊髓損傷動(dòng)物模型探討TRB3對(duì)脊髓損傷修復(fù)的影響及潛在應(yīng)用價(jià)值。此外，未來(lái)應(yīng)對(duì)TRB3小分子抑制劑進(jìn)行研究，以期為應(yīng)激依賴性細(xì)胞死亡疾病如SCI的輔助治療提供新思路。