硫化氫及其合成酶抑制劑對小鼠急性胰腺炎自噬功能的影響

徐玲玲 鳳輝 殷國建 周春華 王少峰

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·論著·

硫化氫及其合成酶抑制劑對小鼠急性胰腺炎自噬功能的影響

徐玲玲 鳳輝 殷國建 周春華 王少峰

目的 探討給予外源性硫化氫(H2S)及其合成酶抑制劑炔丙基甘氨酸(PAG)對雨蛙素誘導(dǎo)的小鼠急性胰腺炎(AP)自噬功能的影響。方法 60只雄性BALB/c小鼠，按數(shù)字表法隨機分為對照組、AP組、硫氫化鈉(NaHS)組、PAG組。采用連續(xù)6次腹腔注射雨蛙素(50 μg/kg體重)、每次間隔1 h的方法建立小鼠AP模型。NaHS組及PAG組在造模前1 h分別腹腔注射NaHS 10 mg/kg體重、PAG 50 mg/kg體重，對照組及AP組小鼠腹腔注射等容積生理鹽水。于第1次注射雨蛙素12 h后處死小鼠，取血檢測血清淀粉酶、脂肪酶含量，采用去蛋白分光光度法測定血清H2S含量；取部分胰腺組織常規(guī)行病理學(xué)檢查并進(jìn)行病理評分；采用Real-time PCR法檢測胰腺組織硫化氫合成酶胱硫醚-γ裂解酶(CSE)mRNA表達(dá)，蛋白質(zhì)印跡法檢測胰腺組織自噬相關(guān)的微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)與LC3-Ⅰ的比值及泛素結(jié)合蛋白(p62)的表達(dá)。結(jié)果 對照組血清淀粉酶、脂肪酶、H2S濃度及胰腺組織CSE mRNA、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值和p62表達(dá)量分別為(2 700±100 )U/L、(70±20 )U/L、(22.9±1.7)mmol/L、1.0±0.1、0.419±0.080、0.227±0.140； AP組小鼠分別為(17 290±500)U/L 、(520±40)U/L、 (31.3±3.0)mmol/L、5.4±0.4、1.184±0.120、1.985±0.210； NaHS組分別為(27 784±1 200)U/L、(900±80)U/L、(38.6±3.3)mmol/L、6.9±0.9、1.600± 0.210、4.229±0.050；PAG組分別為(13 750±2 000)U/L、(370±20)U/L、(24.5±2.1)mmol/L、4.2±0.5、0.745±0.130、1.203±0.080。AP組上述指標(biāo)均顯著高于對照組，NaHS組又較AP組進(jìn)一步顯著升高，而PAG組較AP組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。NaHS組胰腺病理損傷較AP組進(jìn)一步加重，而PAG組胰腺病理損傷較AP組顯著減輕。結(jié)論 PAG能夠降低血清淀粉酶、脂肪酶水平，減輕AP時自噬功能的受損狀況，減輕AP的嚴(yán)重程度。

胰腺炎； 硫化氫； 炔丙基甘氨酸； 自噬

Correspondingauthor:WangShaofeng,Email:sfwang59@sina.cn

急性胰腺炎(AP)是多種病因?qū)е碌囊鹊鞍酌冈谝认賰?nèi)被異常激活而引起的胰腺組織自身消化、水腫、出血壞死的炎癥反應(yīng)，近年來該病發(fā)病率有上升趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，AP時，在動物和人的胰腺組織中均可發(fā)現(xiàn)大量自噬空泡，且抑制自噬可緩解AP的炎癥反應(yīng)和組織損傷[1-2]，認(rèn)為自噬受損參與了AP胰腺腺泡空泡形成及胰蛋白酶原的激活[3]。硫化氫(H2S)作為一種重要的氣體信號分子，具有分子量較小、起效快等優(yōu)點，參與機體廣泛的生理、病理過程[4]，其中一種重要的機制便是調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡和自噬[5]。雖然近年來有關(guān)H2S在多種疾病中自噬通路方面的研究越來越多，但其對AP時自噬的作用尚未見相關(guān)報道。因此，本研究采用腹腔注射H2S的外源性供體硫氫化鈉(NaHS)及H2S合成酶抑制劑炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine,PAG)干預(yù)AP小鼠，探討H2S及PAG對小鼠AP自噬功能的影響，為臨床上治療AP探索新的策略。

材料與方法

一、材料及試劑

清潔級雄性BALB/c小鼠60只，體重(20±2)g，購于蘇州大學(xué)實驗動物中心，在室溫22℃、相對濕度40%～70%的動物房內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。NaHS、PAG購于美國Sigma公司，雨蛙素(caerulein)購于美國AanSpec公司，與自噬相關(guān)的微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated light chain-3,LC3)、泛素結(jié)合蛋白(ubiquitin binding protein,p62/SQSTM1,p62)抗體購于美國Abcam公司。cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Thermo公司，熒光定量PCR SYBR green mix試劑盒購于諾唯贊公司，H2S合成酶胱硫醚-γ 裂解酶(cystathionine γ-lyase, CSE)及內(nèi)參GAPDH引物購于上海生工生物工程有限公司。

二、動物分組及模型制備

實驗小鼠造模前禁食過夜，自由飲水。將小鼠按數(shù)字表法隨機分為對照組、AP組、NaHS組、PAG組，每組15只。采用腹腔注射雨蛙素50 μg/kg體重6次、每次間隔1 h的方法建立小鼠AP模型。NaHS組及PAG組在造模前1 h分別腹腔注射NaHS 10 mg/kg 體重、PAG 50 mg/kg體重。對照組及AP組小鼠腹腔注射等容積生理鹽水。于第1次注射雨蛙素12 h后處死小鼠，取血離心分離血清，同時快速取出胰腺組織，部分置4%中性甲醛液固定，部分液氮冷凍后置-70℃冰箱保存。

三、血清淀粉酶、脂肪酶及H2S含量檢測

血標(biāo)本送蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科應(yīng)用全自動生化分析儀測定血清淀粉酶、脂肪酶含量；采用去蛋白的分光光度法檢測血清H2S含量。

四、胰腺組織病理學(xué)檢查

取固定的胰腺組織，常規(guī)行病理學(xué)檢查，并采用雙盲法按Schmidits標(biāo)準(zhǔn)對胰腺組織進(jìn)行病理評分。

五、胰腺組織CSE mRNA表達(dá)檢測

應(yīng)用TrIzol試劑提取胰腺組織總RNA，按RT-PCR試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板，按照SYBR Premix EX Taq 試劑盒說明書進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。CSE上游引物序列為5′-GGGTCTTGCTGCCACCATTA-3′，下游引物序列為5′-TGTGGTGTAATCGCTGCCTC-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-TGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3′，下游引物序列為5′-GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3′。

六、胰腺組織LC3及p62表達(dá)檢測

取凍存的胰腺組織，應(yīng)用RIPA裂解液試劑提取總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測LC3及p62蛋白，以GAPDH作為內(nèi)參。LC3及p62一抗工作濃度 1∶1 000，最后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。LC3蛋白經(jīng)分離后出現(xiàn)2個條帶，分子質(zhì)量較大的為LC3-Ⅰ，較小的為LC3-Ⅱ。采用Image J軟件進(jìn)行條帶掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白相對表達(dá)量，并計算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值。

七、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組血清淀粉酶及脂肪酶比較

與對照組比較，AP組血清淀粉酶[(17 290±500)U/L比(2 700±100 )U/L]、脂肪酶[(520±40)U/L比(70±20 )U/L]均顯著上升；與AP組比較，PAG組淀粉酶[(13 750±2 000)U/L]、脂肪酶[(370±20)U/L]均顯著下降，而NaHS組淀粉酶[(27 784±1 200)U/L]、脂肪酶、(900±80)U/L]均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。

二、各組血清H2S含量比較

AP組小鼠血清H2S含量較對照組顯著升高[(31.3±3.0)mmol/L比(22.9±1.7)mmol/L]；PAG組血清H2S含量[(24.5±2.1)mmol/L]較AP組顯著下降，而NaHS組[(38.6±3.3)mmol/L]較AP組顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。

三、各組胰腺組織病理學(xué)改變

對照組胰腺小葉形態(tài)正常；AP組胰腺小葉間水腫明顯，炎癥細(xì)胞浸潤，腺泡結(jié)構(gòu)破壞；NaHS組胰腺組織病變較AP組加重，炎癥細(xì)胞浸潤增多，水腫及細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞更加明顯；而PAG組較AP組胰腺組織病變減輕，炎癥細(xì)胞浸潤及水腫程度減輕(圖1)。各組胰腺病理評分見表1。

圖1 對照組(1A)、AP組(1B)、NaHS組(1C)、PAG組(1D)胰腺組織的病理改變(HE ×200)

組別只數(shù)水腫炎癥壞死對照組150±00±00±0AP組153．0±0．0a2．6±0．1a1．8±0．1aNaHS組153．0±0．2a3．0±0．2ab2．1±0．2aPAG組153．0±0．0a2．1±0．2abc1．4±0．2abc

注：與對照組比較，aP<0.05；與AP組比較，bP<0.05；與NaHS組比較，cP<0.05

四、各組胰腺組織CSEmRNA表達(dá)量比較

與對照組比較，AP組胰腺組織CSEmRNA的表達(dá)量升高(5.4±0.4比1.0±0.1)；與AP組比較，PAG組CSEmRNA表達(dá)量(4.2±0.5)顯著下降，而NaHS組CSEmRNA表達(dá)量(6.9±0.9)顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。

五、各組胰腺組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值及p62表達(dá)量比較

AP組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值及p62的表達(dá)量均顯著高于對照組(1.184±0.120比0.419±0.080，1.985±0.210比0.227±0.140)，NaHS組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值 (1.600±0.210) 及p62表達(dá)量(4.229±0.050)較AP組進(jìn)一步升高，而PAG組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值(0.745±0.130) 及p62表達(dá)量(1.203±0.080) 較AP組顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05 ，圖2)。

討 論

H2S是一種無色卻具有臭雞蛋氣味的氣體，近300多年來，人們一直以為其是有毒的廢氣，直到1989年，Warenyeia等[6]在腦組織中檢測到了H2S。

圖2 對照組(1)、AP組(2)、NaHS組(3)、PAG組(4)胰腺組織LC3及p62蛋白的表達(dá)

近年來，隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)H2S作為一種新型的氣體信號分子廣泛分布于體內(nèi)多種器官和組織中，在許多生理病理活動中都起著非常重要的作用，如調(diào)節(jié)自噬及凋亡、抗氧化、抗炎、舒張血管、神經(jīng)保護(hù)等[7]。生理狀態(tài)下，內(nèi)源性H2S有2種存在形式，其中有2/3的H2S以NaHS的形式存在，另外1/3以H2S氣體分子的形式存在，兩者之間存在著動態(tài)平衡。哺乳動物體內(nèi)，H2S合成酶主要有3種，CSE、胱硫醚-β合成酶(cystathionineβ-synthase,CBS)以及3-巰基丙酮酸鹽硫轉(zhuǎn)移酶(3-mercaptopyruvatesulfurtransferase, 3MTS)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，其合成酶主要是CBS，而外周組織中H2S主要是通過CSE合成。雖然H2S對AP的作用已有相關(guān)報道，但主要傾向于對炎癥反應(yīng)的研究，且其在AP炎癥反應(yīng)中表現(xiàn)出抗炎和促炎的雙重作用，而H2S在AP時對自噬通路功能的影響尚未見相關(guān)研究報道。

自噬是真核細(xì)胞內(nèi)所特有的消化通路，通過降解和回收利用受損細(xì)胞成分及大分子物質(zhì)等有害成分，不僅可以清除受損細(xì)胞，還可以為細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)和能量[8]。自噬對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境及分解代謝過程的穩(wěn)定非常重要，當(dāng)細(xì)胞受到外界不良刺激或者缺乏能量時自噬會迅速上調(diào)，在饑餓的情況下，細(xì)胞內(nèi)自噬水平也會上調(diào)。自噬是先通過雙層膜包裹細(xì)胞內(nèi)待降解產(chǎn)物形成自噬體，自噬體再與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，然后再通過自噬溶酶體內(nèi)多種溶酶體酶降解內(nèi)容物的過程，該過程具有動態(tài)性、溶酶體依賴性及細(xì)胞適應(yīng)等特點[9]。LC3是自噬的特異性標(biāo)志物，胞質(zhì)中存在的可溶性的形式為LC3-Ⅰ，當(dāng)自噬發(fā)生時，LC3-Ⅰ脂化成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ定位于自噬體膜上，參與自噬體膜的延伸及閉合。LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比值大小可以反映自噬水平的高低[1]。在自噬過程中，p62負(fù)責(zé)識別及遞送泛素化蛋白進(jìn)入自噬降解通路，因其本身也是自噬通路的特異性降解產(chǎn)物，所以其也是自噬降解能力的重要評價指標(biāo)[10]。因此，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ聯(lián)合p62被認(rèn)為是監(jiān)測自噬通路功能狀態(tài)的經(jīng)典指標(biāo)，LC3-Ⅱ增高而p62下降，提示自噬被誘導(dǎo)且自噬功能正常，而兩者同時升高則提示自噬降解通路受阻，功能出現(xiàn)障礙[11]。本研究結(jié)果顯示，雨蛙素誘導(dǎo)AP模型后12h胰腺組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高，p62蛋白表達(dá)上調(diào)，提示AP存在自噬受阻情況。

AP時腺泡細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)許多非正常的自噬空泡，且自噬溶酶體的功能降低，自噬效率下降，表現(xiàn)為長壽蛋白降解速率減慢以及p62蛋白表達(dá)的增加，使得大量的酶原顆粒在自噬溶酶體內(nèi)異常激活。有研究表明，敲除AP小鼠胰腺腺泡的自噬調(diào)控相關(guān)基因Atg5后，可明顯減輕小鼠AP的嚴(yán)重程度，且減少細(xì)胞內(nèi)胰蛋白酶原的異常激活[12]。還有研究發(fā)現(xiàn)，AP時誘導(dǎo)自噬，胰腺炎的嚴(yán)重程度會加重，相反，抑制自噬，可減輕胰腺炎的嚴(yán)重程度[13]。因此，抑制或誘導(dǎo)自噬對減輕或加重AP具有極其重要的作用。本研究結(jié)果顯示，給予外源性H2S后AP小鼠血清淀粉酶及脂肪酶含量升高，胰腺組織CSEmRNA表達(dá)顯著上調(diào)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ進(jìn)一步升高，p62蛋白表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，提示給予外源性H2S能夠加重自噬通路功能的損傷，加重AP嚴(yán)重程度。使用CSE抑制劑PAG后小鼠血清淀粉酶及脂肪酶含量下降，CSEmRNA表達(dá)下調(diào)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p62蛋白表達(dá)下降，提示抑制H2S合成能改善AP時自噬功能受損狀況，減輕AP的嚴(yán)重程度。

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(本文編輯：冀凱宏)

The effects of H2S and its synthetase inhibitor on the autophagy in acute pancreatitis mice

XuLingling,FengHui,YinGuojian,ZhouChunhua,WangShaofeng.

DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou21500,China

Objective To investigate the effect of H2S and its synthetase inhibitor propargylglycine (PAG) on the autophagic function in caerulein-induced acute pancreatitis (AP) mice. Methods A total of 60 male BALB/c mice were randomly divided into control, AP, NaHS and PAG group using random number method. AP was induced in mice via hourly intraperitoneal injection of caerulein (50 μg/kg) continuously for 6 hours. NaHS and PAG group received NaHS (10 mg/kg) or PAG (50 mg/kg) 1 h before the AP induction. A equal volume of normal saline solution was injected in control group and AP group. All the mice were killed at 12 h after the first caerulein injection and blood sample was collected for the detection of serum amylase and lipase content. Deproteinization spectrometry was used to detect serum H2S content, and pancreatic tissue was pathological examined and scored. Real-time PCR detected mRNA expression of CSE, and the protein expression of LC3-Ⅱ/LC3 Ⅰ and p62 was measured using Western blot. Results Serum amylase, lipase,H2S, CSE mRNA, LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ and p62 were (2 700±100)U/L, (70±20)U/L,(22.9±1.7)mmol/L,1.0±0.1,0.419±0.080, 0.227±0.140 in control group; (17 290±500)U/L,(520±40)U/L, (31.3±3.0)mmol/L, 5.4±0.4, 1.184±0.120, 1.985±0.210 in AP group; (27 784±1 200)U/L,(900±80)U/L,(38.6±3.3)mmol/L, 6.9±0.9,1.600±0.210, 4.229±0.050 in NaHS group; (13 750±2 000)U/L,(370±20)U/L,(24.5±2.1)mmol/L, 4.2±0.5, 0.745±0.130, 1.203±0.080 in PAG group. All those biomarkers detected above in AP group significantly increased compared with control group, which were much lower than those in NaHS group, but higher than those in PAG group, and the differences were statistically significant (allP<0.05). Pancreatic histological damage in NaHS group was more severe than that in AP group, which in PAG group was less severe than that in AP group. Conclusions PAG could greatly decrease serum amylase and lipase level, and reduce the damage on autophagy and the severity of AP.

Pancreatitis; Hydrogen sulfide; Propargylglycine； Autophagy

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.06.007

215000 江蘇蘇州，蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化科

王少鋒，Email: sfwang59@sina.cn

2016-09-01)