RP－HPLC法測(cè)定核桃外果皮中齊墩果酸的含量

張瑞廷 徐 佳 傅 力

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

RP－HPLC法測(cè)定核桃外果皮中齊墩果酸的含量

張瑞廷 徐 佳 傅 力

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

建立核桃外果皮中齊墩果酸含量測(cè)定的反相高效液相色譜法（RP－HPLC），采用色譜柱為Intersil ODS（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇∶水∶冰乙酸（265∶35∶0.1，V/V）；流速0.8mL/min；進(jìn)樣量20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm；柱溫30℃。結(jié)果表明，齊墩果酸進(jìn)樣量在0.728～7.28μg（r＝0.999 7）范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，齊墩果酸平均回收率 （n＝9）為101.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.44%。測(cè)得核桃外果皮中齊墩果酸含量為2.1mg/100g。該方法簡(jiǎn)便快速，結(jié)果可靠準(zhǔn)確，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好。

反相高效液相色譜法；核桃外果皮；齊墩果酸

核桃外果皮成分復(fù)雜，主要化學(xué)成分有胡桃醌、α－氫化胡桃醌－4－葡萄糖苷、鞣質(zhì)、沒食子酸、胡桃醌生物堿及萘醌等。最新報(bào)道顯示核桃外果皮中存在齊墩果酸［1］，齊墩果酸（oleanolic acid，OA）是五環(huán)三萜類化合物，以游離體和配糖體的形式存在于多種植物中，具有保肝護(hù)肝、抗炎抗菌抗病毒、抗氧化、抗癌等藥理作用［2］，齊墩果酸的分析方法目前尚無國(guó)標(biāo)方法，常用的檢測(cè)方法有薄層色譜法［3］、氣相色譜法［4］、液相色譜法等，其中以液相色譜分析方法居多，對(duì)于不同的檢測(cè)對(duì)象，采用液相色譜法檢測(cè)齊墩果酸的條件均有所不同［5－7］，采用液相色譜法分析核桃外果皮中齊墩果酸尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)在前人研究［8－10］的基礎(chǔ)上，通過對(duì)檢測(cè)條件的優(yōu)化，建立核桃外果皮中齊墩果酸的液相色譜分析方法。齊墩果酸較易溶于氯仿、甲醇、丙酮、乙醇等，但不溶于水和石油醚。本試驗(yàn)在樣品制備過程中，先用乙醇進(jìn)行提取，再用石油醚萃取出極性較小的成分，最后用氯仿萃取齊墩果酸。通過不同極性溶劑的分級(jí)萃取，以保證核桃外果皮中齊墩果酸的提取效果，同時(shí)降低在分析過程中其他成分對(duì)齊墩果酸的干擾。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；

甲醇：色譜純，美國(guó)天地公司；

高效液相色譜儀（配SPD－20A紫外檢測(cè)器，LC solution色譜工作站）：島津LC－20AB，日本Shimadzu公司；

紫外可見光分光光度計(jì)：TU－1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

梅特勒分析天平：XS205，梅特勒－托利多上海有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB－Ⅲ，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE－85C，上海青浦滬西儀器廠；

旋渦混合器：XH－C，常州市國(guó)立試驗(yàn)設(shè)備研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制 稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品9.1mg，用甲醇定容至25mL，搖勻，即得0.396mg/mL的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃保存。

1.2.2 樣品溶液制備 將陰干的核桃外果皮粉碎后過40目篩，得到核桃外果皮粗粉。取50g粗粉加入500mL 95%乙醇浸提，過濾后減壓濃縮，得到乙醇浸膏2.25g，將乙醇浸膏用適量蒸餾水分散，依次用石油醚、氯仿萃取，減壓濃縮各萃取溶液，得到不同萃取部位浸膏。稱取氯仿萃取部位浸膏0.016 0g加入1mL甲醇，渦旋振蕩使其充分溶解，微孔濾膜（0.45μm）過濾，濾液供進(jìn)樣。

1.2.3 HPLC分析條件 色譜柱為Intersil ODS（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇∶水∶冰乙酸 （265∶35∶0.1，V/V）；流速0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量20μL。

1.2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品在紫外可見光分光光度計(jì)上進(jìn)行吸收光譜掃描，掃描波長(zhǎng)范圍190～600nm，得到幾個(gè)最大吸收波長(zhǎng)。在此基礎(chǔ)上利用液相色譜在1.2.5中4種不同的流動(dòng)相，通過比較幾個(gè)最大吸收波長(zhǎng)范圍下的色譜圖篩選出最佳波長(zhǎng)。

1.2.5 流動(dòng)相的選擇 比較甲醇－水－冰乙酸（265∶35∶0.1，V/V）、甲醇－水－三乙胺（85∶15∶0.06，V/V）、乙腈－甲醇－水－乙酸銨（69∶16∶15∶1，V/V）、以及甲醇－0.1mol/L NaH2PO4（85.2∶14.8，V/V）4種流動(dòng)相條件下核桃外果皮中齊墩果酸的分離效果及峰形對(duì)稱性。

1.2.6 線性關(guān)系考察 吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.396mg/mL）2，4，8，10，15，20μL，分別進(jìn)樣3次，以色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 精密度試驗(yàn) 吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.396mg/mL），進(jìn)樣20μL，連續(xù)6次，測(cè)定齊墩果酸的含量，計(jì)算RSD值。

1.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1.2.2制備的樣品溶液，分別在0，2，4，6，8h進(jìn)樣20μL測(cè)定齊墩果酸含量，計(jì)算RSD值。

1.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取 1.2.2制備的樣品溶液，進(jìn)樣20μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定齊墩果酸的含量，計(jì)算RSD值。

1.2.10 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 在已知齊墩果酸含量的核桃外果皮中分別加入14.56，29.12，58.24μg齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，按1.2.2方法制備樣品溶液，微孔濾膜（0.45μm）過濾，按1.2.3色譜條件進(jìn)樣20μL測(cè)定峰面積，計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.2.11 核桃外果皮中齊墩果酸含量測(cè)定 稱取按1.2.2制備得到的核桃外果皮氯仿萃取部位浸膏0.016 0g，加入1mL甲醇，渦旋使其充分溶解，微孔濾膜（0.45μm）過濾，進(jìn)樣20μL分析，重復(fù)測(cè)定3次，經(jīng)外標(biāo)法定量，計(jì)算齊墩果酸的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的紫外吸收掃描

由圖1可知，在紫外分光光度計(jì)上對(duì)齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在208，209，213，214nm 4個(gè)波長(zhǎng)處均有吸收峰，見圖1。

圖1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品吸收光譜圖Figure 1 Absorption spectrum of oleanolic acid standard sample

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

依據(jù)齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品的紫外掃描結(jié)果，在1.2.5中4種不同流動(dòng)相條件下，通過比較208～214nm下的色譜圖，發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)為210nm，流動(dòng)相為甲醇－水－冰乙酸（265∶35∶0.01，V/V）時(shí)，基線相對(duì)平整，分離效果較好，齊墩果酸峰形對(duì)稱（見圖2），故最終選擇210nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖Figure 2 HPLC chromatograms of standard sample

2.3 流動(dòng)相的選擇

當(dāng)采用乙腈－甲醇－水－乙酸銨（69∶16∶15∶1，V/V）以及甲醇－0.1mol/L NaH2PO4（85.2∶14.8，V/V）為流動(dòng)相時(shí)，齊墩果酸與核桃外果皮中其他成分的色譜峰出現(xiàn)疊加，分離效果不甚理想。當(dāng)采用甲醇－水－冰乙酸（265∶35∶0.1，V/V）和甲醇－水－三乙胺（85∶15∶0.06，V/V）為流動(dòng)相時(shí)齊墩果酸的分離效果較好，且峰形比較對(duì)稱。加入少量三乙胺雖然有利于改變峰形［11］，提高分離度，但是三乙胺對(duì)ODS柱的損害較大。因此選擇甲醇－水－冰乙酸（265∶35∶0.1，V/V）為流動(dòng)相，能夠較好的分離齊墩果酸（如圖2所示）。同時(shí)該流動(dòng)相的弱酸性環(huán)境有利于改變峰形。由于齊墩果酸在酸堿條件下均不穩(wěn)定，所以冰乙酸的添加量應(yīng)控制流動(dòng)相的pH值保持在6.5。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖2，得到回歸方程為：Y＝1.087 59×106X＋74 605.9（r＝0.999 7），齊墩果酸進(jìn)樣量在0.728～7.28μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，齊墩果酸的保留時(shí)間約為10min，齊墩果酸和相近的其他峰分離完全（分離度＞1.5）。

2.5 精密度試驗(yàn)

由表1可知，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n＝6）為1.89%，表明精密度良好，能夠滿足試驗(yàn)要求。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Result of precision test（n＝6）

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

由表2可知，齊墩果酸在0，2，4，6，8h含量穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.34%（n＝5）。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of stability test（n＝5）

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

由表3可知，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.96%（n＝6），顯示重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)Table 3 Result of repeating test（n＝6）

2.8 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

由表4可知，齊墩果酸平均加標(biāo)回收率為101.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.44%（n＝9），表明加標(biāo)回收率較好。

2.9 核桃外果皮中齊墩果酸含量測(cè)定

由圖3可知，核桃外果皮中齊墩果酸與其他成分分離較好，且目標(biāo)峰峰形對(duì)稱，經(jīng)外標(biāo)法定量，計(jì)算得出核桃外果皮中齊墩果酸含量為2.1mg/100g。

表4 齊墩果酸加標(biāo)回收率結(jié)果Table 4 Recovery experiment of oleanolic acid（n＝9）

圖3 核桃外果皮的HPLC色譜圖Figure 3 HPLC chromatograms of walnut pericarp

3 結(jié)論

（1）本試驗(yàn)在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線過程中，沒有按傳統(tǒng)配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，而是通過改變進(jìn)樣量的體積來改變標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，提高了試驗(yàn)的精度，減少了在配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液過程中可能出現(xiàn)的誤差。

（2）本試驗(yàn)采用反相高效液相色譜法對(duì)核桃外果皮氯仿萃取部位中的齊墩果酸進(jìn)行定性定量分析，檢測(cè)出齊墩果酸的含量較高，達(dá)到了2.11%，因此從核桃外果皮中提取分離齊墩果酸具有實(shí)際意義，能夠增加核桃外果皮新的利用途徑及經(jīng)濟(jì)附加值。

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Determination of oleanolic acid in walnut pericarp by RP－HPLC

ZHANG Rui－ting XU JiaFU Li

（College of Food Science and Pharmaceutical Science，Xinjiang Agricultural University，Xinjiang，Urumqi830052，China）

The method was established for the determination of oleanolic acid in walnut pericarp by RP－HPLC，with the chromatographic column of intersil ODS（150mm×4.6m，5μm），the mobile phase consisted of methanol∶water∶acetic acid（265∶35∶0.1，V/V）at the flow rate of 0.8mL/min；the injection volume was 20μL；the detection wavelength was 210nm and the column temperature was 30℃.The results showed that the good linear range of oleanolic acid was 0.728～7.28μg（r＝0.999 7），and the average recovery（n＝9）rate was 101.1%with RSD of 2.44%.The content of oleanolic acid in walnut pericarp was 2.1mg/100g.This method is simple and quick.The result is accurate and repeatable.

RP－HPLC；walnut pericarp；oleanolic acid

10.3969/j.issn.1003－5788.2011.03.023

國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2007BAD36B04）；新疆維吾爾自治區(qū)高校科研計(jì)劃科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：XJEDU2008I13）

張瑞廷（1982－）男，新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：zrt00016203＠sina.com

傅力

2011－03－25