山核桃葉提取物的抗氧化活性比較

何志平龐林江茅林春孫佳麗

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310029）

山核桃葉提取物的抗氧化活性比較

何志平1，2龐林江1茅林春2孫佳麗1

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310029）

采用1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力、還原能力、超氧陰離子清除能力評(píng)價(jià)不同山核桃葉提取液的抗氧化活性，采用Folin酚法測(cè)定提取液的總酚質(zhì)量濃度。結(jié)果表明，山核桃葉提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，并以甲醇和蒸餾水提取物的抗氧化活性最強(qiáng)；60%甲醇溶液的提取物具有最高的DPPH自由基清除能力，總酚得率最高，達(dá)到（10.63±0.31）mg／g山核桃葉。

山核桃葉；抗氧化；總酚；提取液

山核桃與核桃一樣，同屬胡桃科木本植物，主要分布于浙、皖兩省交界的天目山區(qū)周圍，僅浙江省山核桃面積就超過(guò)417萬(wàn)hm2。目前，山核桃的開發(fā)主要圍繞其果仁、果殼、外果皮進(jìn)行［1－2］：王冀平等［3］發(fā)現(xiàn)山核桃果仁中不飽和脂肪酸含量高達(dá)61.69%～70.89%；房祥軍等［4］發(fā)現(xiàn)果仁中多酚含量為4.71%。丁之恩等［5］利用微波－催化劑法成功制備出山核桃殼活性炭；林君陽(yáng)等［6］發(fā)現(xiàn)外果皮具有較強(qiáng)的抑菌活性；劉元慧等［7］對(duì)外果皮的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，從中分離鑒定出了12種化合物。然而，針對(duì)中國(guó)山核桃葉的研究，尤其是山核桃葉的抗氧化活性和化學(xué)成分研究還未見報(bào)道。在歐洲，人們將核桃葉提取物作為治療靜脈功能不全、痔病等疾病的傳統(tǒng)藥物［8］。許多研究［9］證實(shí)核桃葉具有消炎、抗癌以及降血糖、降血壓等生理活性。據(jù)報(bào)道［10］，核桃葉中含有多種酚類化合物如萘醌類及其衍生物、黃酮類、二芳基庚烷類化合物、大量鞣質(zhì)等。Pereira等［11］利用反相高效液相色譜法鑒定了不同品種核桃葉中含有的10種酚類化合物，并且發(fā)現(xiàn)6個(gè)不同品種核桃葉都具有較高的抗氧化能力和抑菌能力。Amaral等［12］發(fā)現(xiàn)核桃葉中主要酚類為金絲桃苷，其次為4－肉桂?？崴?，他們還發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)的核桃葉中的總酚含量也有明顯的變化，其中以五月份的含量最高。Almeida等［8］在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)核桃葉提取物能有效清除活性氧族和活性氮族自由基。

本試驗(yàn)采用不同極性的提取溶劑分別對(duì)山核桃葉進(jìn)行抽提，并對(duì)各提取物的體外抗氧化、總酚含量進(jìn)行測(cè)定研究，以期為山核桃葉的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃葉（Carya cathayensis Sarg.）：9月中旬采摘于浙江臨安昌化，樹齡為10年，葉子著生于葉軸中端，顏色青，無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)褐斑和病蟲害的葉子作試驗(yàn)材料。

1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（DPPH），沒食子酸，L－抗壞血酸：美國(guó)Sigma公司；

抗超氧陰離子自由基測(cè)試盒：南京建成生物工程研究所；

其他試劑：均為市售分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DGG－9053AD型，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH4，國(guó)華電器有限公司；

超聲波清洗器：KQ－500B，昆山市超聲儀器有限公司；

可見分光光度計(jì)：722型，上海光譜儀器有限公司；

冷凍離心機(jī)：GL－20G－Ⅱ，上海安亭科學(xué)儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理 將采集的山核桃葉用清水洗凈，在30℃ 下用電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱干燥60 min，然后在研缽中利用液氮將葉子研磨粉碎，過(guò)60目篩，凍干后將葉子粉裝于密封塑料袋中，置于－20℃冰箱中備用。

1.3.2 提取液制備 稱取0.5 g核桃葉粉裝于50 m L離心管中，分別加入蒸餾水、甲醇、丙酮、異丙醇、石油醚20 m L，在室溫放入超聲波清洗器中提取30 min，然后使用冷凍離心機(jī)內(nèi)以1 000 g的速度離心8 min，取出上清液，作抗氧化指標(biāo)和總酚測(cè)定。提取液質(zhì)量濃度以每毫升提取液中新鮮葉子的添加質(zhì)量來(lái)計(jì)算。

1.3.3 DPPH自由基清除能力測(cè)定 取一定量提取液至離心管中，加提取劑補(bǔ)足至200μL（最終質(zhì)量濃度為0.3，0.6，1.2 mg／m L），再加入3.8 m L DPPH（0.04 mg／m L）溶液中，震蕩搖勻，在30℃的水浴鍋中遮光30 min，517 nm測(cè)定吸光值。提取物清除DPPH自由基清除能力（DPPH Scavenging Activity，DSA）按式（1）計(jì)算：

式中：

DSA——提取物清除DPPH自由基清除能力，%；

A——樣品液與DPPH溶液混合后的吸光度；

A0——無(wú)水乙醇代替樣品測(cè)得的吸光度。

1.3.4 還原能力測(cè)定 取一定量提取液至離心管中，加提取劑補(bǔ)足至1 m L（最終質(zhì)量濃度為5，10，15，20 mg／mL），再加2.5 mL 的磷酸緩沖液（0.2 mol／L，p H 6.6）和2.5 m L K3Fe（CN）6（0.03 mol／L），并在50 ℃烘箱內(nèi)培養(yǎng)20 min。隨后加入2.5 m L 10%三氯醋酸，1 000 g離心10 min。取上清液2 m L，加入到2.5 m L蒸餾水和0.5 m L 0.006 mol／L的FeCl3體系中反應(yīng)10 min，以空白為參照，在700 nm下測(cè)吸光值，吸光度越大則樣品的還原能力越強(qiáng)［13］。

1.3.5 超氧陰離子清除能力測(cè)定 采用抗超氧陰離子自由基測(cè)試盒［14］。將各提取液稀釋成6.25μg／m L的待測(cè)液，取120μL進(jìn)行試驗(yàn)，檢測(cè)各提取物對(duì)超氧陰離子自由基的抑制率，試驗(yàn)重復(fù)3次。以VC為標(biāo)準(zhǔn)樣，制作VC抑制超氧陰離子能力標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)VC質(zhì)量濃度在0.02～0.1 mg／mL時(shí)，VC含量與超氧陰離子抑制率成線性關(guān)系（y＝7.740 5x＋0.009 3，y為抑制率，x為VC含量）?？钩蹶庪x子自由基活力單位的定義：在反應(yīng)體系中，每升提取液或每克核桃葉提取物在37℃反應(yīng)40 min所抑制的超氧陰離子自由基相當(dāng)于1 mg的VC所抑制的超氧陰離子自由基的變化值為1個(gè)活力單位。

1.3.6 總酚含量的測(cè)定 取0.1 m L提取液原液至離心管中，稀釋至1 m L，加入1 m L稀釋兩倍的福林酚試劑（2 N），3 min后加入3 m L 2%碳酸鈉，25℃避光放置2 h后765 nm測(cè)定吸光值。以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)樣，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，總酚含量以沒食子酸當(dāng)量來(lái)計(jì)算。提取液中的總酚含量以每毫升中總酚的沒食子酸當(dāng)量來(lái)計(jì)算，山核桃葉總酚含量以每克山核桃葉提取得到的總酚沒食子酸當(dāng)量來(lái)計(jì)算［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑對(duì)提取液清除DPPH自由基能力的影響

核桃葉提取液質(zhì)量濃度為0～0.5 mg／mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率具有量效關(guān)系見圖1，DPPH自由基清除率隨著提取液質(zhì)量濃度增加而提高。提取液質(zhì)量濃度為0.3 mg／mL時(shí)，5種提取液DPPH自由基清除率如圖1所示。對(duì)DPPH自由基清除率的大小排序?yàn)椋赫麴s水＞甲醇＞丙酮＞異丙醇＞石油醚。蒸餾水相清除能力最高，與其他4種不同提取液存在顯著性差異（P＜0.01）。石油醚相最低，后續(xù)試驗(yàn)中石油醚提取液不再檢測(cè)。

圖1 提取劑對(duì)核桃葉清除DPPH自由基的影響Figure 1 The effect of different extractant on DPPH radical scavenging activity of chinese hickory leaves

2.2 提取劑對(duì)提取液還原力的影響

在核桃葉提取液質(zhì)量濃度為0～25 mg／m L時(shí)，核桃葉提取液質(zhì)量濃度與還原力具有量效關(guān)系，還原力大小隨著提取液質(zhì)量濃度增加而提高。提取液質(zhì)量濃度為15 mg／mL時(shí)，4種提取液的還原力如圖2所示，還原力順序?yàn)榧状迹菊麴s水＞丙酮＞異丙醇。甲醇相還原力最高，與其他4種不同提取液存在顯著性差異（P＜0.05）。異丙醇相最低。

圖2 提取劑對(duì)核桃葉還原力的影響Figure 2 The effect of different extractant on reducing power of chinese hickory leaves

2.3 提取劑對(duì)提取液抑制超氧陰離子能力的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，核桃葉提取液質(zhì)量濃度為0～12.5μg／mL時(shí)對(duì)抑制超氧陰離子具有量效關(guān)系，超氧陰離子抑制率隨著提取液質(zhì)量濃度增加而提高。當(dāng)提取液質(zhì)量濃度為6.25μg／m L時(shí)抑制超氧陰離子能力見表1。由表1可知各提取相中，甲醇相和蒸餾水相要比丙酮相和異丙醇相高（P＜0.01），甲 醇 相 和 蒸 餾 水 相 之 間 無(wú) 顯 著 差 異（P＞0.05）。

表1 提取劑對(duì)核桃葉提取液抑制超氧陰離子的影響+Table 1 The effect of different extractant on superoxide anion scavenging activity of chinese hickory leaves（mean±SD）

2.4 提取溶劑對(duì)總酚提取得率的影響

試驗(yàn)中，甲醇、丙酮、異丙醇、蒸餾水4種溶劑對(duì)山核桃葉總酚提取得率見表2（以干基計(jì)）。提取得率均介于0.94和1.01之間，提取得率最高的是甲醇提取液；其次是水提液和丙酮提取液；最低為異丙醇提取液。

2.5 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取液清除DPPH自由基能力的影響

從2.1～2.4試驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)，甲醇提取液和蒸餾水提取液相比其他提取相來(lái)講，清除DPPH自由基的能力、還原力、抑制超氧陰離子的能力以及總酚提取得率均最高。為進(jìn)一步優(yōu)化甲醇與蒸餾水的提取效果，以清除DPPH自由基為指標(biāo)，考察甲醇與水的比率對(duì)核桃葉清除DPPH自由基的影響，結(jié)果見圖3。在甲醇體積分?jǐn)?shù)為0%～60%時(shí)，DPPH自由基清除率隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)增加而變大。在甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，DPPH自由基清除率最高，達(dá)77.7%，然后逐漸減小。這說(shuō)明60%的甲醇水溶液最適宜提取山核桃葉中的清除DPPH自由基的抗氧化物。在該條件下，測(cè)得總山核桃葉總酚含量為（10.63±0.31）mg／g。

表2 不同提取溶劑的總酚提取得率Table 2 Extraction yield（in percentage）and total phenols contents in the extracts of the different solvents of the Carya cathayensis leaves（mean±SD）

圖3 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)甲醇水提取液清除DPPH自由基的影響Figure 3 The effect of concentration of methanol water solution on DPPH radical scavenging activity of chinese hickory leaves

2.6 核桃葉多酚與抗氧化活性相關(guān)分析

相關(guān)性分析表明，總酚含量與超氧陰離子自由基抑制率、還原力之間存在顯著正相關(guān) （R＝0.89，P＜0.05；R＝0.90，P＜0.05）而與DPPH自由基清除率相關(guān)性不顯著（R＝0.69，P＞0.05）。說(shuō)明多酚是核桃葉抑制超氧陰離子自由基和提供還原力的主要成分，而且核桃葉還存在有清除DPPH自由基的其他成分，具體物質(zhì)還有待進(jìn)一步分析。

3 討論

本試驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)甲醇、蒸餾水、丙酮、異丙醇萃取后獲得的山核桃葉提取液均具有一定的抗氧化活性。甲醇相、蒸餾水相的清除DPPH自由基能力、還原力、抑制超氧陰離子能力要高于丙酮相、異丙醇相。進(jìn)一步的優(yōu)化試驗(yàn)表明，60%甲醇溶液的提取物具有最高的DPPH自由基清除能力，總酚得率最高，達(dá)到（1.01±0.02）%。此時(shí)計(jì)算的山核桃葉的多酚含量為（10.63±0.31）mg／g山核桃葉。由于不同提取溶劑所得的提取相中酚類物質(zhì)有明顯的差異，在以后的試驗(yàn)中，可以采用先用甲醇提取，然后用其他有機(jī)溶劑如氯仿等進(jìn)行二次浸提，從而提高山核桃葉的總酚提取得率。

對(duì)于山核桃葉來(lái)講，不同品種、采收季節(jié)對(duì)葉中總酚含量的影響以及酚類化合物的鑒定還有待進(jìn)一步開展。本試驗(yàn)證實(shí)山核桃葉與核桃葉（Juglans regia L.）一樣，也具有良好的抗氧化功能和豐富的多酚類物質(zhì)。本試驗(yàn)的研究結(jié)果揭示了山核桃葉具有良好的開發(fā)前景。

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Antioxidant activities in the extracts from Chinese hickory（carya cathayensis sarg.）leaves

HE Zhi－ping1，2PANG Lin－jiang1MAO Lin－chun2SUN Jia－li1

（1.School of Agriculture and Food Science，Zhejiang A ＆ F University，Hangzhou，Zhejiang311300，China；2.College of Biosystem Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou，Zhejiang310029，China）

The effect of different solvent on antioxidant activities and total phenolic content of extracts of Chinese hickory leaves was investigated in this work.Several methods for determining antioxidant activities of the samples were employed included DPPH radical scavenging activity，reducing power and superoxide anion scavenging activity.The total phenolic was determined by folin phenol agent.The results showed that all extracts provided various antioxidant activities and methanol and water extracts possessed the highest effect.the optimum concentration of methanol water solution for the extract with highest DPPH elimination was 60%.The sanll effect of different solvent on total phenolic content of extracts was also founded in this research.The highest extraction yield of total phenolic was 10.09±0.24 mg gallic acid equivalents／g of fresh leaves in methanol extract.

Chinese hickory leaves；antioxidant；total phenolic；extract

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.03.014

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：Y3090428；Y3100422；Y3110340）

何志平（1977－），男，浙江農(nóng)林大學(xué)講師，博士研究生。E－mail：hzhping＠163.com

茅林春

2011－01－31