黑木耳多糖的羧甲基化及其對肝癌細(xì)胞Hep G2的抑制作用

張 華王振宇，2楊 鑫楊 林王 雪

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090；2.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040；3.德之馨（上海）有限公司，上海 201206）

黑木耳多糖的羧甲基化及其對肝癌細(xì)胞Hep G2的抑制作用

張 華1王振宇1，2楊 鑫1楊 林1王 雪3

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090；2.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040；3.德之馨（上海）有限公司，上海 201206）

對提取分離的黑木耳多糖進(jìn)行羧甲基化，并對人體肝癌HepG2細(xì)胞株進(jìn)行干擾研究，探討其增殖抑制作用。將HepG2細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，對處在對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞進(jìn)行對照試驗(yàn)。結(jié)果表明，黑木耳中性多糖組、黑木耳酸性多糖組對HepG2細(xì)胞毒試驗(yàn)得到細(xì)胞存活率50%時(shí)的藥物濃度范圍在200～600μg／m L。兩種未經(jīng)羧甲基化改性的黑木耳多糖在體外對人HepG2細(xì)胞具有抑制作用，而經(jīng)羧甲基化改性的黑木耳多糖則沒有。

黑木耳酸性多糖；羧甲基化黑木耳酸性多糖；黑木耳中性多糖；羧甲基化黑木耳中性多糖；肝癌細(xì)胞HepG2；體外試驗(yàn)

黑木耳（auricularia auricular）屬于真菌門擔(dān)子菌綱木耳目木耳科，是中國重要的藥食兼用真菌［1］，黑木耳多糖具有調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)、降血脂、抗腫瘤、抗輻射、增強(qiáng)腸胃功能和護(hù)肝等功效［2－4］。

多糖分子中的取代基對多糖的活性影響很大，因此對多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造有望得到活性更強(qiáng)、應(yīng)用范圍更廣的多糖衍生物［5］。多糖羧甲基化能增大多糖溶解度和電負(fù)性，可以提高多糖的水溶性，能給多糖增強(qiáng)或增添新的活性［6－9］，因其具有制備過程簡單、試劑成本低及生成物無毒性等優(yōu)點(diǎn)，已成為一種較常用的多糖衍生化方法［10］。

癌癥是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，從天然產(chǎn)物中尋找預(yù)防和治療惡性腫瘤的活性成分始終是藥物化學(xué)家研究的熱點(diǎn)之一［11］。本試驗(yàn)通過水提醇沉得到黑木耳粗多糖，經(jīng)十六烷基三甲基溴化銨分級得到黑木耳酸性多糖（AAAP）和黑木耳中性多糖（NAAP），并制備羧甲基化衍生物，用紅外光譜（FTIR）對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征后，進(jìn)一步驗(yàn)證4種黑木耳多糖對人肝癌Hep G2細(xì)胞增殖的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

黑木耳：產(chǎn)自黑龍江省大興安嶺，市售。

1.1.2 試劑

二甲基亞砜（DMSO 溶液），3－（4，5二甲基噻唑－2）－2，5二苯基四甲基溴化銨（thiazolyl blue，MTT）：美國西格瑪化工有限公司；

DMEM培養(yǎng)基：賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司；

胎牛血清：杭州四季青有限公司；

青鏈霉素：北京索萊寶科技有限公司；

其他試劑：均為分析純。

1.1.3 細(xì)胞株

腫瘤細(xì)胞株、人肝癌細(xì)胞株Hep G2：由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院細(xì)胞庫提供。培養(yǎng)要求：貼壁培養(yǎng)。

1.2 主要儀器

高速萬能粉碎機(jī)：FW100，天津市泰斯特儀器有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：T6新世紀(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

真空冷凍干燥機(jī)：DS－1，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：JY92－Ⅱ，寧波新芝生物科技股份有限公司；

紅外光譜儀：FTIR，美國珀金埃爾默公司；

酶標(biāo)儀：BIO－RAD 550，美國伯樂公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑木耳多糖的制備 將黑木耳清洗、除雜、干燥、粉碎后過40目篩，制成黑木耳干粉，采用石油醚進(jìn)行脫脂處理，脫脂后的粉末用95%乙醇進(jìn)行索氏提取脫去低聚糖，晾干，備用。準(zhǔn)確稱取黑木耳干粉，按60∶1（V∶m）液料比加入蒸餾水浸泡后進(jìn)行超聲輔助萃取處理，然后沸水浴浸提5 h，提取液以4 500 r／min離心10 min，殘?jiān)偬崛?次。合并上清液，減壓濃縮，3倍體積的95%乙醇醇沉，靜置過夜。4 500 r／min離心15 min，收集沉淀加蒸餾水溶解，乙醇沉淀4 500 r／min離心15 min，重復(fù)3次。最終將所得沉淀加入少量蒸餾水溶解，流水透析72 h以除去乙醇及其他小分子雜質(zhì)，透析后清液經(jīng)減壓濃縮后，真空冷凍干燥制得黑木耳粗多糖。

1.3.2 脫色及去除小分子 配制濃度0.5%的黑木耳多糖粗糖液，滴加3%的雙氧水，45℃水浴中保溫3 h，逆水流自來水透析48 h，蒸餾水透析24 h，減壓濃縮，3倍體積的95%乙醇醇沉，靜置過夜后4 500 r／min離心15 min，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，冷凍干燥，制得黑木耳精多糖。

1.3.3 黑木耳酸性多糖和中性多糖的制備 黑木耳中性多糖和酸性多糖分別為黃白色纖維狀和黃褐色晶體狀物質(zhì)，室溫下能溶于水，易溶于熱水，水溶液呈透明狀。將脫色后的黑木耳精多糖配制成濃度為0.5%的多糖液，加入一定體積的0.5%十六烷基溴化三甲胺（CTAB）溶液，酸性多糖與CTAB作用形成不溶于水的沉淀，4 500 r／min離心15 min，將得到的沉淀溶解于100 m L 4 M的NaCl中，靜止過夜，4 500 r／min離心10 min，得到的清液置于3 500 Da透析袋中自來水透析72 h，蒸餾水透析48 h，減壓濃縮后，3倍體積的95%乙醇醇沉，冷凍干燥得黑木耳酸性多糖；中性多糖則留在母液中，經(jīng)透析、濃縮、醇沉而分離。

1.3.4 羧甲基化黑木耳多糖的制備 多糖羧甲基化反應(yīng)機(jī)理見圖1。稱取經(jīng)CTAB分級得到的黑木耳酸性多糖和中性多糖各1 g，分別分散于30倍的異丙醇中，室溫下攪拌6 h，加入40倍60%（m／V）的NaOH溶液，于85℃水浴回流1.5 h，在15 min內(nèi)加入60倍60% （m／V）的氯乙酸，混合物于65℃恒溫反應(yīng)4 h，并不斷攪拌，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，反應(yīng)液用5 mol／L鹽酸調(diào)至中性，過濾，濾液用流動水透析3 d，蒸餾水透析1 d，濃縮，用甲醇醇沉，沉淀由甲醇∶水＝1∶1洗滌數(shù)次，冷凍干燥得羧甲基化的黑木耳酸性多糖（CMC AAAP）和中性多糖（CMC NAAP）［8］。

圖1 多糖羧甲基化反應(yīng)機(jī)理Figure 1 Reaction mechanism of carboxymethylation polysaccharide

1.3.5 羧甲基化黑木耳多糖的紅外光譜分析 取羧甲基化的黑木耳酸性多糖和中性多糖樣品1 mg，KBr壓片，掃描4 000～400 cm－1的紅外光譜。

1.3.6 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 細(xì)胞增殖試驗(yàn)用 MTT法進(jìn)行測定［12－13］。取對數(shù)生長期HepG2腫瘤細(xì)胞，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入4×105cells／mL 100μL培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后調(diào)整黑木耳酸性多糖、羧甲基化黑木耳酸性多糖、黑木耳中性多糖和羧甲基化黑木耳中性的終濃度分別為50，100，150，200，250，300，400，500μg／mL，每個(gè)濃度及對照均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。以加有細(xì)胞而不含藥物的培養(yǎng)液孔為對照孔。用酶標(biāo)儀測定各孔吸光值，計(jì)算4種黑木耳多糖不同濃度對Hep G2腫瘤細(xì)胞增殖抑制率。抑制率按式（1）計(jì)算：

以同一樣品的不同濃度對腫瘤細(xì)胞生長抑制率，運(yùn)用CalcuSyn DEMO軟件求出藥物半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2 結(jié)果和討論

2.1 羧甲基化黑木耳酸性多糖和中性多糖制備

采用異丙醇為反應(yīng)媒介，用NaOH水溶液作為堿，以ClCH2COOH為羧甲基化試劑，對黑木耳酸性多糖和黑木耳中性多糖進(jìn)行羧甲基化，羧甲基化黑木耳酸性多糖和中性多糖的得率分別為22.26%和19.12%。

2.2 羧甲基化黑木耳酸性多糖和中性多糖的紅外光譜分析

羧甲基化后黑木耳多糖的水溶性明顯增強(qiáng)，F(xiàn)TIR分析表明，羧甲基化黑木耳酸性多糖和中性多糖具有多糖類物質(zhì)的特征吸收峰，其中3 600～3 200 cm－1區(qū)域的吸收峰為糖的特征吸收峰，是由羥基O－H的伸縮振動引起的，表明存在分子間和分子內(nèi)氫鍵；3 000～2 800 cm－1區(qū)域的吸收峰也為糖的特征吸收峰，是由次甲基C－H的伸縮振動引起，表明有－CH2基存在，這兩組峰可以初步判斷該樣品是糖類化合物［14］。

由圖2、3可知，羧甲基化黑木耳酸性多糖在1 613，1 416，1 324 cm－1處出現(xiàn)了－COO－的特征吸收峰，而羧甲基化黑木耳中性多糖在1 613，1 423，1 324 cm－1處出現(xiàn)了－COO－的特征吸收峰，表明這兩種黑木耳多糖已憂功羧甲基化。

圖2 黑木耳酸性多糖和羧甲基化黑木耳酸性多糖紅外光譜圖Figure 2 FTIR spectra of AAAP and CMC AAAP

圖3 黑木耳中性多糖和羧甲基化黑木耳中性多糖紅外光譜圖Figure 3 FTIR spectra of NAAP and CMC NAAP

2.3 黑木耳多糖和羧甲基化黑木耳多糖對HepG2細(xì)胞的抑制作用

不同濃度的羧甲基化黑木耳酸性多糖和黑木耳酸性多糖對HepG2細(xì)胞的抑制作用試驗(yàn)結(jié)果表明：未羧甲基化的黑木耳多糖對Hep G2細(xì)胞的抑制作用明顯高于羧甲基化的（見圖4）；當(dāng)黑木耳酸性多糖濃度為400μg／m L時(shí)，對Hep G2癌細(xì)胞的抑制率達(dá)到最大為50.08%；羧甲基化黑木耳酸性多糖對HepG2癌細(xì)胞的最大抑制率僅為17.56%；隨著黑木耳中性多糖濃度的增高，對Hep G2癌細(xì)胞抑制率明顯增加，而羧甲基化黑木耳中性多糖對Hep G2細(xì)胞則沒有抑制作用（見圖4）。提示這種取代度的黑木耳中性多糖對肝癌細(xì)胞HepG2沒有直接殺傷作用，也表明羧甲基化黑木耳中性多糖在細(xì)胞水平上對細(xì)胞無明顯毒性。經(jīng)calcusyn軟件分析得到黑木耳酸性多糖IC50值578.08μg／m L，而黑木耳中性多糖IC50值218.90μg／m L，因此黑木耳中性多糖對HepG2的抑制作用要高于黑木耳酸性多糖。體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明：黑木耳中性多糖清除羥基自由基和超氧自由基的活性比黑木耳酸性多糖高。

圖4 黑木耳酸性多糖和羧甲基化黑木耳酸性多糖對肝癌Hep G2的抑制作用Figure 4 Inhibition of HepG2 of CMC AAAP and AAAP

3 結(jié)論

（1）黑木耳多糖用氯乙酸鈉改性后，羧甲基化黑木耳酸性多糖和中性多糖的得率分別為22.26%和19.12%，紅外光譜表征這兩種多糖已羧甲基化。

（2）通過對改性多糖的Hep G2的體外抑制增殖試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)改性后的羧甲基化黑木耳多糖對Hep G2的體外抑制增殖作用反而不如未經(jīng)改性的黑木耳多糖，黑木耳中性多糖對HepG2增殖的抑制作用要高于黑木耳酸性多糖。

今后的研究應(yīng)結(jié)合羧甲基化后黑木耳多糖的羧甲基取代度：考慮制備更低取代度的樣品并測試其抑癌活性；進(jìn)一步研究其體外抗氧化活性并篩選羧甲基化黑木耳多糖其它生物活性，如抗病毒活性、抗輻射作用。

1 魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979：123～124.

2 吳春敏.毛木耳多糖的分離、分析及免疫藥理活性的研究［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1991，22（2）：97～100.

3 鄭炯，黃發(fā)明，張坤.黑木耳多糖生物活性研究進(jìn)展［J］.糧食與油脂，2006（10）：45～47.

4 樊黎生，龔晨睿，張聲華.黑木耳多糖抗輻射效應(yīng)的動物實(shí)驗(yàn)［J］.營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2005，27（6）：525～526.

5 Heinze T，Liebert T，Koschella A.多糖酯化反應(yīng)［M］.尹學(xué)瓊，林強(qiáng)，譯.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008：1～3.

6 Wang Y F，Zhang L N，Li Y Q，et al.Correlation of structure to antitumor activities of five derivatives ofβ－glucan from poria cocos sclerotium［J］.Carbohydr Res.，2004，339（15）：2 567～2 574.

7 Chen X G，Wang Z，Liu W S，et al.The effect of carboxymethyl－chitosan on proliferation and collagen secretion of normal and keloid skin fibroblasts［J］.Biomaterials，2002，23（23）：4 609～4 614.

8 El－Sherbiny I M.Synthesis，characterization and metal uptake capacity of a new carboxymethyl chitosan derivative［J］.European Polymer Journal，2009，45（1）：199～210.

9 趙國華，李志孝，陳宗道.化學(xué)改性對山藥多糖抗腫瘤活性的影響［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2004，4（1）：39～42.

10 Verraest D L，Peters J A，Batelaan J G，et al.Carboxymethylation of inulin［J］.Carbohydr.Res.，1995，271（1）：101～112.

11 陳聰穎，陸陽，陳澤乃.天然產(chǎn)物在抗癌藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)中的作用［J］.中草藥，1999，30（2）：144～147.

12 陳波，俞惠新，譚成，等.白藜蘆醇及其衍生物抗氧化、抗腫瘤活性研究［J］.食品與機(jī)械，2007，23（4）：52～55.

13 孫震，蘇宇杰，姚惠源.玉米蛋白粉中黃體素、玉米黃素對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響［J］.食品與機(jī)械，2005，21（2）：52～55.

14 Santhiya D，Subramanian S，Natarajan K A.Surface chemical studies on sphalerite and galena using extracellular polysaccharide isolated from bacillus polymyxa［J］.Journal of Colloid and Interface Science，2002，256（2）：237～248.

In vitro antitumor activities of carboxymethylated derivatives of polysaccharides extracted fromauricularia auricula

ZHANG Hua1WANG Zhen－yu1，2YANG Xin1YANG Lin1WANG Xue3

（1.Shool of Food Science and Engneering，Harbin Institute of Technology，Harbin，Heilongjiang150090，China；2.Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang150040，China；3.Symrise（Shanghai）Co.，Ltd.，Shanghai201206，China）

Cancer has been a challenge for humanity.Many scientific researchers have been exploring antitumor activities of some natural products.It was reported that polysaccharide had good antitumor activities.This paper reports on a water－soluble polysaccharide（AAP）and in how it was ultrasound－assisted and extracted fromAuricularia auricularand fractioned by Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide（CTAB）.Then these two carboxymethylated polysaccharides（acidic polysaccharide，AAAP and neutral polysaccharide，NAAP）were prepared.Additional further explanation is given as to their structural characteristics by Fourier transform infrared spectrometer（FT－IR）.And then inhibition of on the human HepG2 cell proliferation was studied.The results showed toxicity experiments 50%viability of concentrations between the neutral polysaccharide fromAuriculariaand acidic polysaccharide fromAuriculariaon HepG2 cell was range 200 to 600μg／m L.These two polysaccharides fromAuriculariawhich have the potential medicinal value in inhibiting on human Hep G2 cells in vitro，are well worth further studying.

acidauricularia auricularpolysaccharide（AAAP）；carboxymethylated acidauricularia auricularpolysaccharide（CMC AAAP）；neutralauricularia auriculapolysaccharide（NAAP）；carboxymethylated neutralauricularia auriculapolysaccharide（CMC NAAP）；HepG2；in vitro

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.03.013

國家高新技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（編號：2007AA100404）

張華（1977－），女，哈爾濱工業(yè)大學(xué)講師，在讀博士。E－mail：zhhua＠hit.edu.cn

王振宇

2011－03－01