產(chǎn)紫紅色素菌株的篩選及誘變

胡博涵劉素純何 理李海飛

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；4.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640）

產(chǎn)紫紅色素菌株的篩選及誘變

胡博涵1劉素純2，3何 理4李海飛1

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；4.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640）

以土壤和3種水果為樣品，馬鈴薯－抗生素培養(yǎng)基為基質(zhì)，采用稀釋平板法分離產(chǎn)紫紅色素的菌株，并以產(chǎn)紫紅色素菌株為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變。結(jié)果表明：從蘋果表面上獲得1株產(chǎn)紫紅色素的真菌，通過個(gè)體形態(tài)和菌落特征初步分析為鐮孢菌屬菌株（fusarium sp.），該菌以馬鈴薯－蔗糖（35%）為基質(zhì)發(fā)酵，獲得胞內(nèi)紫紅色素OD值為0.790，胞外色素OD值為0.538，該突變菌株獲得其胞內(nèi)紫紅色素OD值為0.895，胞外色素OD值為0.503，且該突變菌株產(chǎn)生色素的速度要快于出發(fā)菌株1 d。

紫紅色素；OD值；誘變

科技的發(fā)展使合成色素在食品中使用造成人體健康危害的證據(jù)得以證實(shí)。近年來，食品行業(yè)的“蘇丹紅”事件被頻頻曝光，使人們對(duì)食品色素的安全性格外警惕，甚至談“紅”色變。雖然各種合成紅色素色澤鮮艷、著色力強(qiáng)［1］、堅(jiān)牢度大、性質(zhì)較穩(wěn)定，但與合成色素相比，天然色素具有無毒副作用、安全性高［2］，有一定的營養(yǎng)價(jià)值和保健功能［3－6］，著色比較自然，更接近于天然物質(zhì)的顏色等特點(diǎn)［7－8］，在現(xiàn)代食品工業(yè)發(fā)展中正逐漸被重視。它不僅廣泛應(yīng)用于干料、酒類、糕點(diǎn)、糖果等飲料和食品當(dāng)中，而且也應(yīng)用于醫(yī)藥和化妝品的生產(chǎn)中［9］。自然界中能產(chǎn)生色素的微生物種類非常豐富［10－11］，利用微生物資源進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵或固態(tài)培養(yǎng)產(chǎn)紅色素，能克服以動(dòng)植物為原料生產(chǎn)天然色素的諸多缺點(diǎn)，不受資源、環(huán)境和空間的限制，并且易于工業(yè)化，是高效、低成本獲得天然色素的有效途徑，成為天然色素來源的主流。本試驗(yàn)以土壤和水果為材料，通過菌株篩選和誘變，得到高產(chǎn)紫紅色素菌株，并對(duì)其發(fā)酵條件優(yōu)化進(jìn)行研究，為真菌色素的進(jìn)一步開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

土壤：取自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地；蘋果、葡萄、柑橘：市售。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯－抗生素培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，p H自然，添加鏈霉素10～50 mg或氯霉素12.5～25 mg，定容1 L。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L。

SDAY培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母10 g，瓊脂20 g，水1 L。

察氏培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂（MgSO4·7 H2O）0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂20 g，水1 L。

淀粉培養(yǎng)基：可溶性淀粉15 g，酵母膏4 g，瓊脂20 g，水1 L。

酵母蔗糖培養(yǎng)基：酵母膏20 g，蔗糖150 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂20 g，水1 L。

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，及蔗糖20 g，水定容為1 L，p H自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯180～220 g，及蔗糖或葡萄糖20～30 g，水定容至1 L，p H自然。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離 取樣品25 g放到裝有225 m L無菌含有玻璃珠的生理鹽水的500 m L三角瓶中，搖蕩20 min，作系列稀釋度，取稀釋液10－1、10－2及10－3各1.0 m L放入無菌平皿；再加馬鈴薯－抗生素培養(yǎng)基10～15 mL混合均勻，靜置1 min，重復(fù)2次，于28℃倒置培養(yǎng)72 h；將培養(yǎng)基上有色素的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)72 h，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株的微生物學(xué)特性及鑒定 將有色素菌株在馬鈴薯液態(tài)培養(yǎng)基上28℃倒置培養(yǎng)72 h，進(jìn)行菌落特征觀察，并用棉蘭水浸片法制作標(biāo)本片，在顯微鏡下400倍觀察個(gè)體形態(tài)，根據(jù)菌株的培養(yǎng)特性和形態(tài)特征，對(duì)照《真菌鑒定手冊(cè)》，確定其屬。

1.2.3 液態(tài)搖瓶發(fā)酵 液態(tài)搖瓶發(fā)酵獲取色素發(fā)酵液種子：300 mL的錐形瓶中盛裝種子培養(yǎng)基90～100 mL，接種斜面菌種，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)基初始p H為自然，轉(zhuǎn)速220 r／min，發(fā)酵時(shí)間72～84 h，即得搖瓶發(fā)酵液。再將發(fā)酵種子按5%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別接到不同培養(yǎng)基中發(fā)酵。

1.2.4 色素測(cè)定 發(fā)酵后，取發(fā)酵液入離心管中置高速離心機(jī)中10 000 r／min下離心10 min，得上清液和菌絲體。將收集到的菌絲體于50～60℃烘干5 h，用研缽充分研磨菌絲體，使細(xì)胞完全破碎，將獲得的烘干菌體按固液質(zhì)量比1∶3加入70%～95%（V／V）酒精，浸提4～6 h，離心得上清液。所有上清液均在520 nm處以酒精作參比，測(cè)定其OD值。

1.2.5 菌株紫外誘變 采用功率15 W，照射距離20 cm，分別對(duì)相同濃度和體積的孢子菌懸液進(jìn)行紫外處理，時(shí)間分別為15，30，60，90 s，將處理過的孢子懸液及對(duì)照懸液涂布于平板培養(yǎng)基上，避光28℃培養(yǎng)3 d，統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)并計(jì)算致死率，選出最佳誘變計(jì)量處理孢子懸液。以菌落大小及顏色為指標(biāo)進(jìn)行初篩，以生物量和色價(jià) （OD值）進(jìn)行復(fù)篩［12］。對(duì)經(jīng)紫外線誘變的菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，選出色素含量增加的菌株。并對(duì)誘變菌株作穩(wěn)定性試驗(yàn)：將復(fù)篩出的菌株繼代5次，選出色素產(chǎn)量穩(wěn)定的菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫紅色素菌株的篩選和鑒定

對(duì)土壤和水果樣品進(jìn)行稀釋平板分離獲得1株產(chǎn)紫紅色素的真菌，將產(chǎn)生色素的菌落，用棉蘭水浸片法制作標(biāo)本片，在顯微鏡下400倍觀察個(gè)體形態(tài)（圖1）：菌絲有隔，有紫紅色素（圖1（a）），分枝，分生孢子梗分枝或不分枝。小型分生孢子卵圓形至柱形，有1～2個(gè)隔膜；大型分生孢子鐮刀形或長(zhǎng)柱形，有較多的橫隔，稍彎；足細(xì)胞明顯（圖1（b））。

圖1 菌株的個(gè)體形態(tài)Figure 1 Strain of individual figure

菌落特征觀察：在馬鈴薯液態(tài)培養(yǎng)基上28℃倒置培養(yǎng)72 h的菌株，菌落呈圓形為紫紅色，邊緣為全緣狀；菌落質(zhì)地為最初呈白色絨毛狀，迅速變?yōu)樽霞t色、紫色，外觀呈絨毛狀，菌絲生長(zhǎng)較快，長(zhǎng)；馬鈴薯培養(yǎng)基上氣生菌絲白色，淺粉色至紫色，絮狀，絨毛狀，生長(zhǎng)迅速（見圖2）。

圖2 菌株的菌落特征Figure 2 Strain of colonies character

根據(jù)菌株的培養(yǎng)特性和形態(tài)特征，對(duì)照《真菌鑒定手冊(cè)》，初步斷定為鐮孢菌屬菌株（fusarium sp.）。

2.2 菌株發(fā)酵產(chǎn)生紫紅色素的培養(yǎng)基質(zhì)的篩選

采用PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、SDAY培養(yǎng)基、酵母蔗糖培養(yǎng)基和淀粉培養(yǎng)基進(jìn)行液態(tài)搖瓶培養(yǎng)觀察產(chǎn)色素情況，發(fā)現(xiàn)只有PDA培養(yǎng)基能使菌株產(chǎn)生紫紅色素。其他培養(yǎng)基除察氏培養(yǎng)基有點(diǎn)紫色外均為無色或黃色。

對(duì)PDA培養(yǎng)基中糖的種類和數(shù)量進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蔗糖和葡萄糖隨著濃度的增加色素量在35%處到達(dá)高峰值后迅速下降。說明糖濃度太高使得細(xì)胞處于高滲透壓環(huán)境而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。兩種糖的使用中蔗糖比葡萄糖產(chǎn)生的色素OD高（見表1）。

表1 出發(fā)菌株在不同濃度蔗糖和葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生色素的OD值Table 1 Optical density of strain pigment using differ concentration sucrose and glucose

2.3 誘變菌株與出發(fā)菌株發(fā)酵色素的比較

經(jīng)紫外誘變初篩和復(fù)篩獲得一突變菌株L4，該菌落色澤較深而且菌體大，將此菌株L4與出發(fā)菌株L0在相同條件下進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生紫紅色素的時(shí)間比出發(fā)菌株提前1 d，測(cè)定其OD值，結(jié)果見表2。由表2可知，L4在不同蔗糖濃度下的色素OD值高于L0，而且胞內(nèi)色素明顯提高，胞外色素低于L0。同時(shí)對(duì)其誘變菌株傳代5次后進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，其色素保持不變。

表2 誘變菌株L4與出發(fā)菌株L0色素產(chǎn)生量的差別Table 2 Difference of pigment capacity for mutated strain and original strain

3 結(jié)論

微生物色素具有植物色素和動(dòng)物色素不可比擬的優(yōu)越性。篩選出有較好開發(fā)前景的產(chǎn)色素高產(chǎn)菌株，進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵或固態(tài)培養(yǎng)生產(chǎn)出無毒、高色價(jià)的天然紅色素，將其運(yùn)用于食品色素、制藥色素和化妝品色劑等領(lǐng)域，不僅會(huì)為消費(fèi)者帶來健康，而且會(huì)為開發(fā)者帶來經(jīng)濟(jì)效益。本試驗(yàn)篩選的紫紅色素色價(jià)較高，顏色純正。進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)后附著在瓶壁上不易清洗，具有很強(qiáng)的著色能力，而且出發(fā)菌株胞外色素多，誘變菌株胞內(nèi)色素產(chǎn)生的速度快，具有極大的開發(fā)價(jià)值。

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Screening and mutation of amaranth pigment－producing fungus

HU Bo－h(huán)an1LIU Su－chun2，3HE Li4LI Hai－fei1

（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan410128，China；2.Hunan Provincial Research Center of Engineering and Technology for Fermented Food，Changsha，Hunan410128，China；3.Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology，Changsha，Hunan410128，China；4.College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou，Guangdong510640，China）

Dilution plate method was adopted to screen amaranth pigment－producing fungus from soil and fruits using potato－antibiotic culture medium.The result indicated that a fungus strain obtained from apple surface with amaranth pigment－producing activity was identified asFusarium oxysporumby observation of its cell shape and colony characteristics.After fermentation of the original screened strain in potato sucrose－（35%）nutrient medium，the OD values of intracellular and extracellular amaranth pigment were 0.790 and 0.538，respectively.As for the mutation－treated strain，the OD values of intracellular and extracellular amaranth pigment were 0.895 and 0.503.Besides，the mutation－treated strain could finish pigment production one day earlier than the original strain.Our work laid a foundation for the research on production of amaranth pigment from microorganism fermentation.

amaranth pigment；optical density（OD）；mutation

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.03.009

2010年湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：SCX1010）

胡博涵（1990－），男，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程專業(yè)在讀本科生。E－mail：hubohan＿11＠126.com

劉素純

2011－03－20