新疆酸駝乳中細(xì)菌素乳酸菌的篩選及其抑菌性

武 運(yùn)李 遠(yuǎn)王冰峰張曉燕阿伊古扎麗巴吐爾

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

新疆酸駝乳中細(xì)菌素乳酸菌的篩選及其抑菌性

武 運(yùn)1李 遠(yuǎn)1王冰峰2張曉燕1阿伊古扎麗1巴吐爾1

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

通過雙層瓊脂擴(kuò)散打孔法，從新疆哈薩克族傳統(tǒng)發(fā)酵酸駝乳中分離的23株乳酸菌中，篩選出9株對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌具有抑菌活性的菌株（其中菌株MLS5抑菌活性最強(qiáng)）。通過有機(jī)酸、過氧化氫抑菌的排除試驗(yàn)和蛋白酶敏感性試驗(yàn)，初步確定MLS5產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)為蛋白質(zhì)類細(xì)菌素。溫度和p H耐受試驗(yàn)表明，該細(xì)菌素具有良好的熱穩(wěn)定性（121℃，20 min），p H 3～6具有抑菌活性。菌株MLS5的發(fā)酵曲線表明，菌株在37℃培養(yǎng)條件下具有良好的產(chǎn)細(xì)菌素和產(chǎn)酸能力，該細(xì)菌素在菌體生長對數(shù)中期產(chǎn)生，在生長穩(wěn)定期抑菌活性達(dá)到最大。經(jīng)抑菌譜試驗(yàn)表明，MLS5所產(chǎn)細(xì)菌素不僅能抑制革蘭氏陽性細(xì)菌，而且對大腸桿菌和毛霉菌也有抑制作用，具有較廣的抑菌譜。

酸駝乳；乳酸菌；細(xì)菌素；篩選；抑菌性

新疆發(fā)酵酸駝乳是由哈薩克族傳統(tǒng)的發(fā)酵菌發(fā)酵制備而成的，其中蘊(yùn)涵著大量的微生物，尤其是乳酸菌。酸駝乳既是食品，又是一種民族藥。有研究［1］認(rèn)為酸駝乳對肺結(jié)核、腸胃炎和心血管等疾病有治療作用，且具有抗炎作用，這可能與酸駝乳中的益生菌有關(guān)。

乳酸菌是一種在食品發(fā)酵工業(yè)中廣泛應(yīng)用的益生菌。已有研究［2］表明有些乳酸菌代謝可以產(chǎn)生細(xì)菌素、有機(jī)酸、過氧化氫、雙乙酰等多種天然抑菌物質(zhì)。乳酸菌細(xì)菌素是乳酸菌在代謝過程中合成并分泌到環(huán)境中的一類對親緣關(guān)系較近，有抑（殺）菌作用的蛋白或多肽類物質(zhì)。很多乳酸菌都能夠產(chǎn)生細(xì)菌素，目前報(bào)道［3］的有40余種乳酸菌細(xì)菌素，它們對熱的敏感范圍和生化特性等有較大差異［4］。乳酸菌產(chǎn)生的抑菌活性代謝產(chǎn)物細(xì)菌素，不僅可以改善腸道生態(tài)，而且可以抑制或殺死一些病原菌和食物腐敗菌［5］。Rogers［6－7］報(bào)道了由乳酸乳球菌 （lactococcus lactis）產(chǎn)生的對保加利亞乳桿菌（lactobacillus bulgaricus）有抑制作用的物質(zhì)乳鏈球菌肽（nisin）。自乳酸乳球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素Nisin獲準(zhǔn)作為安全性高的食品防腐劑以來，細(xì)菌素的研究已成為微生物學(xué)研究中一個(gè)活躍的領(lǐng)域［8］。

本試驗(yàn)就新疆哈薩克族傳統(tǒng)發(fā)酵酸駝乳中產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌進(jìn)行篩選，并對其抑菌性進(jìn)行初步研究，以期為中國傳統(tǒng)食品中優(yōu)良菌株的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌株

23株乳酸菌：分離自新疆哈薩克族傳統(tǒng)發(fā)酵酸駝乳；

金黃色葡萄球菌 （staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis）、大腸桿菌（escherichia coli）、釀酒酵母（saccharomyces cerevisiae）、灰綠青霉（penicillium glaucum）和毛霉菌（mucor）：本實(shí)驗(yàn)室提供；

蠟樣芽孢桿菌（bacillus cereus）、堅(jiān)強(qiáng)腸球菌（enterococcus durans） 和 巴 斯 德 醋 酸 菌 （acetobacter pasteurianus）：分離自發(fā)酵食品。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基［9］，用于培養(yǎng)乳酸菌；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基［10］，用于抑菌試驗(yàn)；LB培養(yǎng)基［10］，用于培養(yǎng)指示細(xì)菌；察氏培養(yǎng)基［10］，用于培養(yǎng)酵母及霉菌。

1.1.3 試劑過氧化氫酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶：Sigma公司；蛋白酶K：北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.1.4 儀器

立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋：LD2X－30KA，上海申安醫(yī)療器械廠；

生物安全柜：HR40－ⅡA2，青島海爾特種電器有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DHP－9162，上海一恒科技有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DZKW－D2，北京永光明醫(yī)療儀器廠；

生物顯微鏡：XSP－2CA，廈門Motic實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；

臺(tái)式離心機(jī)：GL－100，上海安婷科學(xué)儀器廠；

手持p H計(jì)：TRANS WIGGENS，Senz Pal公司。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)細(xì)菌素菌株的篩選

（1）乳酸菌發(fā)酵液的制備：將活化后的乳酸菌發(fā)酵液以1%的接種量分別接種于10 m L裝有MRS液體培養(yǎng)基的Ep管中［11］，37 ℃ 培 養(yǎng) 箱 恒 溫 培 養(yǎng) 24 h，1 000 r／min 離 心10 min，收集上清液。

（2）指示菌菌懸液的制備：以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌為菌株篩選的指示菌，將活化后的指示菌發(fā)酵液以1%的接種量接種于50 m L LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24 h。

（3）篩選方法：采用雙層瓊脂孔洞法。將10 mL滅菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（瓊脂含量2%）傾注于直徑90 mm的培養(yǎng)皿中，保持水平待其凝固作為底層，加入1 m L指示菌液，傾入20 m L冷卻至45℃的LB培養(yǎng)基（瓊脂含量0.75%［12］），輕搖混勻后水平放置使其凝固，作為菌層。10 mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基不做培養(yǎng)菌體用。其作用：① 使皿底均勻，減小試驗(yàn)誤差；② 做緩沖層，防止菌液擴(kuò)散過快或過慢以至擴(kuò)散不均；③ 膠粘作用，防止菌液滲漏影響抑菌效果。抑菌試驗(yàn)實(shí)際培養(yǎng)基為20 m L。通過預(yù)試驗(yàn)顯示，加底層培養(yǎng)基抑菌效果明顯好于不加底層的。用直徑10 mm的無菌打孔器在菌層打孔后，用無菌鑷子將孔中央菌層培養(yǎng)基夾出，使其形成直徑10 mm的圓孔，向孔洞內(nèi)加入待試乳酸菌發(fā)酵上清液150μL，以滅菌 MRS液體培養(yǎng)基為空白對照，37℃培養(yǎng)24 h后觀察有無抑菌圈形成，并測量其抑菌直徑。

1.2.2 細(xì)菌素蛋白質(zhì)性質(zhì)的確定 采用逐步排除干擾因素的方法，確定有抑菌作用的菌株產(chǎn)生的細(xì)菌素的蛋白質(zhì)性質(zhì)。

（1）有機(jī)酸抑菌的排除試驗(yàn)：先用1 mol／L NaOH和1 mol／L HCl調(diào)發(fā)酵上清液的p H 值分別為3.5，4.5，5.5，6.5，以相應(yīng)p H值的乳酸為對照，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，確定對照p H值。將發(fā)酵上清液調(diào)至對照p H值，以相應(yīng)p H值的MRS液體培養(yǎng)基為對照，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。指示菌為金黃色葡萄球菌。

（2）過氧化氫抑菌的排除試驗(yàn)：用1 mol／L NaOH和1 mol／L HCl將發(fā)酵上清液調(diào)至過氧化氫酶的最適作用p H值7.0，將發(fā)酵上清液用1 mol／L的過氧化氫酶在37℃水浴1 h，再將p H值調(diào)回對照p H值，以未經(jīng)酶處理的發(fā)酵上清液為對照，以金黃色葡萄球菌為指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

（3）細(xì)菌素的蛋白酶敏感性試驗(yàn)：用蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K）對發(fā)酵上清液進(jìn)行酶分解試驗(yàn)。先用1 mol／L NaOH和1 mol／L HCl分別將發(fā)酵上清液調(diào)至蛋白酶的最適作用p H值（胃蛋白酶調(diào)至3.0，胰蛋白酶和蛋白酶 K調(diào)至7.0），按1 mg／m L加入蛋白酶，37℃水浴2 h，再將p H值調(diào)回對照p H值，以未經(jīng)酶處理的發(fā)酵上清液為對照，以金黃色葡萄球菌為指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)菌素對溫度和p H值的耐受性試驗(yàn)

（1）細(xì)菌素對溫度的耐受性試驗(yàn)：將發(fā)酵上清液分別于60，80，100，121℃加熱處理20 min，以未經(jīng)加熱處理的發(fā)酵上清液為對照，以金黃色葡萄球菌為指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

（2）細(xì)菌素對p H值的耐受性試驗(yàn)：將發(fā)酵上清液分別調(diào) p H 值為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，測定其抑菌圈大小，以相應(yīng)p H值的MRS液體培養(yǎng)基為對照，以金黃色葡萄球菌為指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.4 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的發(fā)酵曲線

（1）產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌培養(yǎng)溫度的確定：將活化后的細(xì)菌素高產(chǎn)菌株培養(yǎng)液以1%的接種量分別接種于10 mL裝有MRS液體培養(yǎng)基的Ep管中，分別于30，37，42℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24 h，以MRS液體培養(yǎng)基為空白對照，每隔2 h在600 nm處分別測其光密度值（OD）及發(fā)酵上清液的p H值，并以金黃色葡萄球菌為指示菌測其抑菌活性。

（2）產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的發(fā)酵曲線：以1.2.4（1）中確定的培養(yǎng)溫度，繪制產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌24 h內(nèi)的發(fā)酵曲線。

1.2.5 抑菌譜的測定 取細(xì)菌素高產(chǎn)菌株的發(fā)酵上清液，選取革蘭氏陽性細(xì)菌（金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)腸球菌、枯草芽孢桿菌），革蘭氏陰性細(xì)菌（大腸桿菌、巴斯德醋酸桿菌）和真菌（啤酒酵母菌、灰綠青霉菌、毛霉菌）作為指示菌，用雙層瓊脂孔洞法檢測細(xì)菌素的抑菌譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選結(jié)果

各供試乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素的的抑菌活性如表1所示，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌3種指示菌均有抑菌活性的菌株有9株，其中MLS5菌株的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈的直徑分別達(dá)22.6，22.0，21.3 mm。

表1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌篩選結(jié)果+Table 1 Results on screening of bacteriocinproducing lactic acid bacteria

2.2 細(xì)菌素蛋白質(zhì)性質(zhì)的確定

2.2.1 有機(jī)酸抑菌的排除試驗(yàn)結(jié)果 乳酸菌發(fā)酵液對指示菌的抑制作用可能是代謝合成的細(xì)菌素引起的，也可能是發(fā)酵產(chǎn)物如乳酸、乙酸及其它有機(jī)酸作用的結(jié)果。菌株MLS5的發(fā)酵上清液的試驗(yàn)結(jié)果見表2和圖1，當(dāng)p H值為4.5時(shí)，乳酸對指示菌沒有作用，而發(fā)酵上清液對指示菌有抑制，可見有機(jī)酸對指示菌沒有抑菌性，可排除有機(jī)酸的干擾。

表2 對照p H值的確定結(jié)果+Table 2 Results of compare p H value

圖1 有機(jī)酸抑菌的排除試驗(yàn)結(jié)果Figure 1 Results on inhibitive effect of organic acids exclusion test

2.2.2 過氧化氫抑菌的排除試驗(yàn)結(jié)果 乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生的強(qiáng)氧化劑過氧化氫也可以抑制細(xì)菌的生長，因此必須排除過氧化氫的干擾。菌株MLS5的發(fā)酵上清液過氧化氫排除的試驗(yàn)結(jié)果見表3，過氧化氫對指示菌抑制作用很小，從而排除過氧化氫對細(xì)菌素抑菌活性的干擾。

表3 過氧化氫抑菌的排除和蛋白酶敏感性試驗(yàn)結(jié)果+Table 3 Results on inhibitive effect of organic acids exclusion test and protease susceptibility test

2.2.3 細(xì)菌素的蛋白酶敏感性試驗(yàn)結(jié)果 乳酸菌發(fā)酵液中，為了確定對指示菌的抑制作用為蛋白質(zhì)類細(xì)菌素，經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K分別對發(fā)酵上清液進(jìn)行酶解后的抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表3。發(fā)酵上清液對胃蛋白酶不敏感，而對胰蛋白酶和蛋白酶K敏感，從而初步確定發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)為蛋白質(zhì)類細(xì)菌素。

2.3 細(xì)菌素對溫度和p H值的耐受性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 細(xì)菌素對溫度的耐受性試驗(yàn)結(jié)果 細(xì)菌素對溫度的耐受性試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，發(fā)酵上清液在不同溫度加熱處理后仍具有較強(qiáng)的抑菌活性，121℃處理20 min后抑菌圈直徑為20.1 mm，抑菌活性相對于發(fā)酵上清液原液略有降低，但抑菌活性仍然較明顯。

表4 細(xì)菌素對溫度的耐受性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results on temperature tolerance of bacteriocin

2.3.2 細(xì)菌素對p H的耐受性試驗(yàn)結(jié)果 細(xì)菌素對p H的耐受性試驗(yàn)結(jié)果見表5。發(fā)酵上清液在p H 3～6的范圍內(nèi)具有抑菌活性，隨著p H的升高抑菌活性逐漸下降，至p H 7時(shí)，細(xì)菌素已不具有抑菌活性。

表5 細(xì)菌素對p H的耐受性試驗(yàn)結(jié)果+Table 5 Results on p H tolerance test of bacteriocin

2.4 菌株MLS5的發(fā)酵曲線結(jié)果

菌株MLS5在30，37，42℃條件下的生長、p H及抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)，MLS5的生長、產(chǎn)酸及抑菌活性均優(yōu)于30℃和42℃，因此，將37℃確定為MLS5的培養(yǎng)溫度。菌株MLS5在37℃培養(yǎng)24 h的發(fā)酵曲線見圖2。由圖2可知，菌株MLS5培養(yǎng)2～4 h進(jìn)入對數(shù)生長期，p H值降低，培養(yǎng)4～6 h發(fā)酵上清液開始具有抑菌活性。

圖2 菌株MLS5 37℃的發(fā)酵曲線Figure 2 Fermentation curve of strain MLS5 at the temperature of 37℃

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，發(fā)酵上清液的抑菌活性逐漸增強(qiáng)，p H值逐漸降低。菌體生長至14 h時(shí)，其抑菌活性達(dá)到最大直徑為22.4 mm，p H達(dá)到最低3.97。14 h后，菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期，其抑菌活性及p H值變化也趨于穩(wěn)定。

2.5 抑菌譜的測定

菌株MLS5細(xì)菌素的抑菌譜試驗(yàn)結(jié)果見表6。由表6可知，菌株MLS5產(chǎn)生的細(xì)菌素不僅能抑制革蘭氏陽性細(xì)菌，對大腸桿菌和毛霉也有較好的抑制作用，因而該細(xì)菌素具有較廣的抑菌譜。

表6 菌株MLS5細(xì)菌素的抑菌譜試驗(yàn)結(jié)果+Table 6 Results on antibacterial spectrum of MLS5 bacteriocin

3 結(jié)論

（1）從新疆哈薩克族傳統(tǒng)發(fā)酵酸駝乳中分離的23株乳酸菌中，通過雙層瓊脂擴(kuò)散打孔法篩選出9株對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌具有抑菌活性的菌株，其中菌株MLS5抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈的直徑分別達(dá)22.6，22.0，21.3 mm。

（2）通過有機(jī)酸、過氧化氫抑菌的排除試驗(yàn)和蛋白酶敏感性試驗(yàn)，排除有機(jī)酸、過氧化氫抑菌的干擾，并初步確定MLS5產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)為具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的細(xì)菌素。

（3）溫度和p H耐受試驗(yàn)表明，乳酸菌MLS5產(chǎn)生的細(xì)菌素具有良好的熱穩(wěn)定性（121℃，20 min），p H 3～6具有抑菌活性，隨著p H的升高抑菌活性逐漸下降。

（4）菌株MLS5的發(fā)酵曲線表明，菌株在37℃培養(yǎng)條件下具有良好的產(chǎn)細(xì)菌素和產(chǎn)酸能力，該細(xì)菌素在菌體生長對數(shù)中期產(chǎn)生，在生長穩(wěn)定期抑菌活性達(dá)到最大。

（5）經(jīng)抑菌譜試驗(yàn)表明，菌株MLS5發(fā)酵液不僅能抑制革蘭氏陽性細(xì)菌，對大腸桿菌和毛霉也有較好的抑制作用，因而該細(xì)菌素具有較廣的抑菌譜。

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12 李秀涼，雷虹，孟博，等.肽類抑菌物質(zhì)效價(jià)的測定［J］.食品科技，2006（3）：113～115.

Screening of bacteriocin－producing lactic acid bacteria in hogormag from Xinjiang and study on its bacteriostatic activity

WU Yun1LI Yuan1WANG Bing－feng2ZHANG Xaio－yan1Ayguzal1Batuer1

（1.College of Food Sciences and Pharmaceutical Sciences，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang830052，China；2.College of Science and Technology，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang830052，China）

From 23 strains of lactic acid bacteria isolated from Hazakh traditional fermented camel milk，9 Strains were screened out to exhibit inhibitory activity onS.aureus，B.subtilisandE.coliby doubledeck agar diffusion and punch methods.One strain of MLS5 exhibits the strongest antibacterial activity.The antimicrobial substance produced by MLS5 was initially identified as protein bacteriocin by inhibitive effect of organic acids and hydrogen peroxide exclusion and protease susceptibility test.Temperature and p H tolerance test showed that the bacteriocin still has thermal stability at 121℃for 20 minutes and antibacterial activity at p H 3～6.Fermentation curve of strain MLS5 showed that the strain was capacity of producing bacteriocin and acid at the temperature of 37℃.The bacteriocin was generated from mid－logarithmic growth phase and reached the maximum activity at stationary phase.The inhibitory spectrum results showed that the bacteriocin produced by MLS5 exhibits broad antibacterial spectrum.It can not only inhibit the Gram－positive bacteria，but also inhibitE.coliandMucor.

fermented camel milk；lactic acid bacteria；bacteriocin；screening；antibacterial activity

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.03.008

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（編號(hào)：200803033－A09011）；新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)緊缺人才專業(yè)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（編號(hào)：jqrcp2201003）

武運(yùn)（1965－），女，新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)副教授，碩士。E－mail：wuyunster＠sina.com

巴吐爾

2011－03－09