PTEN在小鼠卵細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育中的功能研究

王喜宏, 和協(xié)超, 韓樹標(biāo), 季維智, 鄭 萍

(1. 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所, 云南 昆明 650223; 2. 中國(guó)科學(xué)院研究生院, 北京 100049)

PTEN在小鼠卵細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育中的功能研究

王喜宏1,2,*, 和協(xié)超1, 韓樹標(biāo)1, 季維智1, 鄭 萍1

(1.中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所,云南 昆明650223; 2.中國(guó)科學(xué)院研究生院,北京100049)

PI3K/AKT信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育中起重要作用。抑癌基因PTEN是該通路中的負(fù)調(diào)節(jié)因子, 但PTEN在卵和早期胚胎中的表達(dá)、分布以及作用都還未見報(bào)道。本研究通過免疫熒光方法發(fā)現(xiàn)卵細(xì)胞及著床前胚胎都表達(dá)PTEN, 且具活性的PTEN主要分布在生發(fā)泡期(germinal vesical, GV)卵細(xì)胞的皮層部位以及致密桑椹胚的卵裂球表面。在培養(yǎng)基中添加低濃度的PTEN特異性抑制劑bpV(pic), GV期卵母細(xì)胞的成熟不受影響, 但著床前胚胎發(fā)育受到阻滯。該結(jié)果提示PTEN在小鼠著床前胚胎發(fā)育中可能起重要作用。

卵細(xì)胞; 著床前胚胎發(fā)育; PTEN; bpV

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族參與多種信號(hào)通路, 調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種功能。正常情況下, 由其活化而產(chǎn)生的類脂產(chǎn)物3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇PtdIns(3,4,5)P3(PIP3)作為第二信使結(jié)合并激活多種細(xì)胞內(nèi)的靶蛋白, 形成一個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)復(fù)合物, 最終調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、存活和遷移等(Manning & Cantley, 2007)。PI3K/AKT信號(hào)通路保持正常的平衡狀態(tài)是細(xì)胞維持正常生理活動(dòng)的關(guān)鍵。PTEN是一種PtdIns(3,4,5)P3-磷酸酶, 它可以通過去磷酸化將PtdIns(3,4,5)P3轉(zhuǎn)變?yōu)镻tdIns(4,5)P2(PIP2), 從而負(fù)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路的穩(wěn)態(tài)。PIP2也是一種重要的信號(hào)分子，可以與胞內(nèi)或細(xì)胞膜上的許多蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用(McLaughlin & Murray,2005)。 PTEN的異常與多種腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(Keniry & Parsons, 2008)。因此，PTEN是重要的抑癌因子之一, 在調(diào)節(jié)細(xì)胞正常生長(zhǎng)也有著舉足輕重的作用。

對(duì)PI3K信號(hào)通路在生殖和發(fā)育中的功能研究則相對(duì)較少, 但已有證據(jù)表明PI3K對(duì)著床前胚胎發(fā)育具重要意義。敲除PI3K的p110b催化亞基會(huì)引發(fā)早期胚胎致死(Bi et al, 2002)。應(yīng)用時(shí)差顯微技術(shù)(time lapse microscopy)也發(fā)現(xiàn)早期胚胎中有持續(xù)的PtdIns(3,4,5)P3生成, 抑制 PtdIns(3,4,5)P3的產(chǎn)生可導(dǎo)致胚胎發(fā)育受阻, 說明PI3K/Akt通路對(duì)早期胚胎發(fā)育起調(diào)控作用(Halet et al, 2008)。在卵細(xì)胞中特異性敲除PTEN, 可使濾泡提前發(fā)育和過度激活, 從而產(chǎn)生卵巢早衰(Reddy et al, 2008);而在顆粒細(xì)胞中特異敲除PTEN則可以增加排卵率和產(chǎn)仔數(shù)并延長(zhǎng)黃體壽命(Fan et al, 2008)。在小鼠初級(jí)卵泡中特異敲除PTEN不能影響卵母細(xì)胞成熟、排卵和產(chǎn)仔數(shù)(Jagarlamudi et al, 2009)。但是到目前為止, PTEN是否也在早期胚胎中表達(dá)并起一定的調(diào)控作用, 尚未見有關(guān)報(bào)道。我們利用免疫組化技術(shù)研究PTEN在小鼠卵和著床前胚胎中的分布, 并利用PTEN特異性抑制劑研究其在卵成熟及早期胚胎發(fā)育中的可能功能，其結(jié)果表明, PTEN在卵細(xì)胞和早期胚胎中持續(xù)表達(dá), 對(duì)早期胚胎發(fā)育可能起調(diào)控作用, 但抑制PTEN對(duì)卵細(xì)胞的成熟沒有顯著作用。

1 材料和方法

1.1 小鼠卵和胚胎的獲取和培養(yǎng)

健康、性成熟的ICR品系SPF (無(wú)特定病源)級(jí)小鼠購(gòu)自昆明金殿動(dòng)物中心。

超排方法:選擇處于間情期和發(fā)情前期的雌性小鼠, 腹腔注射PMSG(5 IU), 間隔46～48 h后腹腔注射hCG(5 IU), 隨即與雄鼠合籠, 翌日8:00 檢查陰栓, 有陰道栓者認(rèn)為已完成交配行為。

胚胎的獲取和體外培養(yǎng)：取出輸卵管和子宮, 用消化或者沖洗的方法獲得胚胎, 在實(shí)體顯微鏡下檢查受精胚胎的發(fā)育階段。一細(xì)胞(兩原核期)胚胎培養(yǎng)在KSOM培養(yǎng)基中, 培養(yǎng)條件為37 ℃, 5% CO2。

GV(生發(fā)泡)卵的獲取：PMSG注射48 h后取出小鼠卵巢, 刺破卵泡獲得質(zhì)量好的COCs, 用機(jī)械吹吸的方法去除顆粒細(xì)胞。GV卵在KSOM培養(yǎng)中進(jìn)行成熟培養(yǎng), 培養(yǎng)條件同上。

培養(yǎng)中使用的PTEN抑制劑bpV(pic)購(gòu)自Calbiochem(Cat：203705).

1.2 免疫組化

體內(nèi)獲取的不同發(fā)育階段的胚胎用PBS洗兩遍, 在3.7%中性多聚甲醛中固定15～20 min, 0.25% Triton-X100中透膜30 min, 1% BSA封閉至少1 h, 一抗4 ℃過夜, 二抗室溫1 h, Hoechst染核。在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。

使用的一抗購(gòu)自恩晶公司, PTEN(Ab-380/382/ 383)Antibody(cat：E021056), PTEN(Phospho-Ser380/ Thr382/Thr383)Antibody(cat：E11056)。100×稀釋。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel軟件卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P＜0.05 定義為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 PTEN蛋白在卵細(xì)胞和早期胚胎中的表達(dá)和分布

我們首先利用PTEN(Ab-380/382/383)抗體檢測(cè)了PTEN總蛋白在卵細(xì)胞和早期胚胎中的表達(dá)和定位, 繼而利用PTEN(Phospho-Ser380/Thr382/Thr383)抗體檢測(cè)了卵和胚胎中磷酸化的PTEN蛋白的表達(dá)和定位。這些位點(diǎn)上磷酸化的PTEN被認(rèn)為是非活化形式(Salmena et al, 2008; Vazquez et al, 2001; Vazquez et al, 2000)。

對(duì)卵細(xì)胞及體內(nèi)發(fā)育各階段的胚胎進(jìn)行總PTEN和磷酸化PTEN免疫熒光染色, 結(jié)果如圖1(大寫A-F為磷酸化PTEN, 小寫a-f為PTEN總蛋白)。PTEN總蛋白在著床前各階段胚胎(圖1a-e)及卵細(xì)胞(圖1f)中都有表達(dá), 主要分布在細(xì)胞核及近細(xì)胞膜上。磷酸化PTEN在一細(xì)胞、二細(xì)胞、四細(xì)胞及囊胚階段與PTEN總蛋白的分布基本一致, 但在致密化桑葚胚階段, 兩者呈現(xiàn)不同的分布：PTEN總蛋白同時(shí)分布在細(xì)胞核及卵裂球表面, 而磷酸化PTEN只分布在細(xì)胞核中。GV期卵細(xì)胞PTEN總蛋白和磷酸化PTEN也存在分布上的差異, 總蛋白分布在細(xì)胞核和近細(xì)胞膜上(圖1f), 而磷酸化PTEN則分布在細(xì)胞核中(圖1F)

2.2 PTEN在卵細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育中的作用

GV期卵細(xì)胞在成熟培養(yǎng)中, 加入不同濃度(0 μmol/L、 1 μmol/L、10 μmol/L)PTEN特異性抑制劑bpV, 觀察對(duì)生發(fā)泡破裂(Germinal vesicle breakdown, GVBD)的影響, 結(jié)果顯示，不加bpV(0 μmol/L)和加1 μmol/L、10 μmol/L bpV的GVBD率分別為86.4%和86.2%、84.6%, 無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

取一細(xì)胞(兩原核期)胚胎在KSOM中培養(yǎng), 培養(yǎng)基中添加0 μmol/L(對(duì)照)、2.5 μmol/L、5 μmol/L以及10 μmol/L濃度梯度的bpV, 每天觀察并記錄各組胚胎發(fā)育的情況。我們發(fā)現(xiàn)bpV的添加顯著抑制胚胎發(fā)育, 而且抑制的程度與濃度正相關(guān)。在濃度較低(2.5 μmol/L和5 μmol/L)時(shí), 二細(xì)胞以后發(fā)育到每個(gè)階段的胚胎數(shù)都有所下降, 經(jīng)過卡方檢驗(yàn), 2.5 μmol/L 和5 μmol/L兩組的四細(xì)胞、桑椹胚、 囊胚的發(fā)育率與對(duì)照組相比具都有顯著差異(P＜0.05)。在較高濃度(10 μmol/L)時(shí)沒有胚胎可以發(fā)育到囊胚, 幾乎所有胚胎的發(fā)育全部被抑制在二細(xì)胞時(shí)期(圖2)。

圖1 胚胎發(fā)育各階段以及GV卵的磷酸化PTEN和總PTEN的分布Fig. 1 Distribution of PTEN and phosphorylated-PTEN in pre-implantation embryos and GV oocytes

圖2 PTEN抑制劑bpV(pic)處理對(duì)早期胚胎發(fā)育的影響Fig. 2 Effect of pbV(pic) treatment on the developmental competence of early embryos

3 討 論

PI3K通路在小鼠胚胎發(fā)育中起重要作用, 在小鼠胚胎中, PI3K從一細(xì)胞胚胎到囊胚都持續(xù)表達(dá)并激活, PI3K和其磷酸化反應(yīng)的產(chǎn)物PtdIns(3,4,5)P3都分布在細(xì)胞表面(Halet et al, 2008; Riley & Carayannopoulos, 2005)。敲除PI3K催化亞基或者抑制PI3K活性可引起早期胚胎致死(Bi et al, 2002; Halet et al, 2008)。PTEN是PtdIns(3,4,5)P3發(fā)生的負(fù)調(diào)控因子，所以在胚胎發(fā)育中很可能也有重要的作用。

我們的結(jié)果表明，PTEN在卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育中持續(xù)表達(dá)。利用PTEN特異性抑制劑bpV阻斷PTEN的活性, 可顯著影響早期胚胎發(fā)育潛能,其效果具劑量依賴性, 說明PTEN對(duì)早期胚胎發(fā)育具調(diào)控作用。PTEN總蛋白和磷酸化蛋白在桑葚胚階段卵分布不一致，活化的PTEN主要分布在裂球表面。該結(jié)果暗示PTEN可能在桑葚胚階段的致密化過程中起某種作用。低濃度的bpV并不能阻斷卵泡的成熟, 這與前人基因敲除的研究結(jié)果一致：在小鼠在初級(jí)卵泡中敲除PTEN不能影響卵母細(xì)胞成熟(Jagarlamudi et al, 2009)。

本實(shí)驗(yàn)中使用的bpV最大濃度為10 μmol/L,本實(shí)驗(yàn)證明該濃度對(duì)于體細(xì)胞和卵細(xì)胞都沒有毒性(Lai, 2007; Schmid et al, 2004; Li et al, 2010)。因此，在該濃度的bpV作用下觀察到的表型應(yīng)該是PTEN活性抑制后產(chǎn)生的真實(shí)作用, 而不是細(xì)胞毒性的副產(chǎn)物。當(dāng)然, PTEN對(duì)胚胎發(fā)育的作用還需通過mRNA表達(dá)的定量研究, 以及PTEN基因表達(dá)的干擾, 如RNA干擾或者基因敲除手段進(jìn)行更為確鑿的驗(yàn)證。抑制PTEN的功能, 一方面可破壞PI3K/AKT通路的平衡, 使AKT過度激活；另一方面也可降低信使分子PIP2的生成。PTEN對(duì)胚胎發(fā)育調(diào)控的詳細(xì)分子機(jī)制還需進(jìn)一步的深入研究。

B i L, Okabe I, Bernard DJ, Nussbaum RL. 2002. Early embryonic lethality in mice deficient in the p110 catalytic subunit of PI 3-kinase[J]. Mamm Genome,13(3): 169-172.

Fan HY, Liu Z, Cahill N, Richards JAS. 2008. Targeted disruption of Pten in ovarian granulosa cells enhances ovulation and extends the life span of luteal cells[J]. Mol Endocrinol,:22(9): 2128-2140.

Halet G, Viard P, Carroll J. 2008. Constitutive PtdIns (3, 4, 5) P3 synthesis promotes the development and survival of early mammalian embryos[J]. Development,135(3): 425.

Jagarlamudi K, Liu L, Adhikari D, Reddy P, Idahl A, Ottander U, Lundin E, Liu K. 2009. Oocyte-specific deletion of Pten in mice reveals a stage-specific function of PTEN/PI3K signaling in oocytes in controlling follicular activation[J]. PLoS One,4(7): e6186.

Keniry M, Parsons R. 2008. The role of PTEN signaling perturbations in cancer and in targeted therapy[J]. Oncogene,27(41): 5477-5485.

Lai J. 2007. Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten (PTEN) as a molecular target in lung epithelial wound repair[J]. Br J Pharmacol,152(8): 1172-1184.

Li J, Kawamura K, Cheng Y, Liu S, Klein C, Duan EK, Hsueh AJW. 2010. Activation of dormant ovarian follicles to generate mature eggs[J]. Proc Natl Acad Sci USA,107(22): 10280.

Manning BD, Cantley LC. 2007. AKT/PKB signaling: navigatingdownstream[J]. Cell,129(7): 1261-1274.

McLaughlin S, Murray D. 2005. Plasma membrane phosphoinositide organization by protein electrostatics[J]. Nature,438(7068): 605-611.

Reddy P, Liu L, Adhikari D, Jagarlamudi K, Rajareddy S, Shen Y, Du C, Tang W, H m l inen T, Peng SL. 2008. Oocyte-specific deletion of Pten causes premature activation of the primordial follicle pool[J]. Science,319(5863): 611.

Riley JK, Carayannopoulos MO. 2005. The PI3K/Akt pathway is present and functional in the preimplantation mouse embryo[J]. Dev Biol,284(2): 377-386.

Salmena L, Carracedo A, Pandolfi PP. 2008. Tenets of PTEN tumor suppression[J]. Cell,133(3): 403-414.

Schmid AC, Byrne RD, Vilar R, Woscholski R. 2004. Bisperoxovanadium compounds are potent PTEN inhibitors[J]. FEBS lett,,566(1-3): 35-38.

Vazquez F, Grossman SR, Takahashi Y, Rokas MV, Nakamura N, Sellers WR. 2001. Phosphorylation of the PTEN tail acts as an inhibitory switch by preventing its recruitment into a protein complex[J]. J Biol Chem,276(52): 48627.

Vazquez F, Ramaswamy S, Nakamura N, Sellers WR. 2000. Phosphorylation of the PTEN tail regulates protein stability and function[J]. Mol Cell Biol,20(14): 5010.

Role of PTEN in mouse pre-implantation development

WANG Xi-Hong1,2,*, HE Xie-Chao1, HAN Shu-Biao1, JI Wei-Zhi1, ZHENG Ping1

(1. Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China; 2. Graduate School of the Chinese Academy of Science, Beijing 100049, China)

The PI3K/Akt signal transduction pathway plays an important role in pre-implantation embryonic development. The tumor suppressor genePTENnegatively regulates the PI3K/Akt pathway. Although PI3K is constitutively activated during pre-implantation embryonic development, currently no evidence shows the presence and possible involvement of PTEN in early embryo development. We investigated the expression of PTEN protein in germinal vesicle (GV) stage oocytes as well as in pre-implantation embryos. The activated form of PTEN was distributed in the peripheral of GV oocytes and compact morula. Treatment of GV oocytes with PTEN inhibitor bpV(pic) did not affect the maturation of the oocyte, but significantly impaired embryonic development. Thus, our study suggests the necessary role of PTEN in pre-implantation embryonic development.

Oocyte; Pre-implantation embryonic development;PTEN; bpV

Q954.4; Q593.4; Q132.4

A

0254-5853-(2011)06-0647-04

10.3724/SP.J.1141.2011.06647

2011-06-16；接受日期：2011-08-15

?通訊作者(Corresponding author)，Tel/fax:+86-871-5198996, E-mail: wangxh06@post.kiz.ac.cn