尼羅羅非魚Orexin前體基因的克隆、組織分布及其在攝食調(diào)控中的表達(dá)

陳文波 , 王 鑫, 周雅璐 董海燕 , 林浩然 李文笙*

(1. 中山大學(xué) 有害生物控制與資源利用國家重點實驗室 水生經(jīng)濟(jì)動物研究所暨廣東省水生經(jīng)濟(jì)動物良種繁育重點實驗室, 廣東 廣州 510275;2. 河南理工大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院生物系, 河南 焦作 454000)

尼羅羅非魚Orexin前體基因的克隆、組織分布及其在攝食調(diào)控中的表達(dá)

陳文波1,2,#, 王 鑫1,#, 周雅璐1, 董海燕1, 林浩然1, 李文笙1,*

(1. 中山大學(xué) 有害生物控制與資源利用國家重點實驗室 水生經(jīng)濟(jì)動物研究所暨廣東省水生經(jīng)濟(jì)動物良種繁育重點實驗室, 廣東 廣州 510275;2. 河南理工大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院生物系, 河南 焦作 454000)

該文采用RT-PCR和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid-amplification of cDNA ends, RACE)的方法, 從尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)下丘腦總RNA中獲得了尼羅羅非魚Orexin前體基因的cDNA全長序列。該 cDNA全長648 bp, 其中開放閱讀框的長423 bp，編碼Orexin前體蛋白為140個氨基酸, 包括37個氨基酸的信號肽、43個氨基酸的Orexin-A、28個氨基酸的Orexin-B和末尾32個氨基酸組成的功能不詳?shù)亩嚯?。采用Real-time PCR 技術(shù)對尼羅羅非魚Orexin前體基因的組織表達(dá)模式以及在攝食前后、饑餓和再投喂?fàn)顟B(tài)下的表達(dá)量變化進(jìn)行了研究。 結(jié)果顯示, 在腦部和外周等18個組織中都檢測到了Orexin前體基因的表達(dá), 其中在下丘腦中表達(dá)量最高; 在攝食前后, 尼羅羅非魚Orexin前體基因的表達(dá)量顯著低于在攝食狀態(tài)中; 饑餓2、4、6和8 d后,Orexin前體基因在下丘腦中的表達(dá)量與正常投喂組相比均顯著升高, 饑餓4 d再投喂后，表達(dá)量又恢復(fù)至正常水平。這些結(jié)果表明, Orexin在尼羅羅非魚攝食中可能有著重要的調(diào)節(jié)作用。

尼羅羅非魚;Orexin; 克隆; 表達(dá); 攝食

魚類攝食和食欲的調(diào)節(jié)與其他脊椎動物類似,也有一個極其復(fù)雜的機(jī)制, 包含腦和外周組織信號的精細(xì)互作(Volkoff et al, 2005)。Orexin由Sakurai等在1998年發(fā)現(xiàn)，是與G蛋白偶聯(lián)的重要神經(jīng)肽,包括 Orexin-A 和 Orexin-B(也稱為 hypocretin-I和hypocretin-II) 兩種。它們是同一種蛋白前體的水解產(chǎn)物, 以其有促進(jìn)攝食作用而得名。Orexin被認(rèn)為是G蛋白偶聯(lián)的細(xì)胞表面受體的配體, 也有人認(rèn)為具有促進(jìn)攝食的功能(de Lecea et al, 1998; Sakurai et al, 1998)。Orexin-A和 Orexin-B均來自同一前體-Orexin原, 經(jīng)蛋白水解而成(Sakurai et al, 1998)。最初用放免法分析發(fā)現(xiàn), Orexin大量分布在下丘腦、延髓、腦橋和中腦, 大腦皮層中也含有, 而內(nèi)臟器官和脂肪組織則無。隨著研究的不斷深入, 發(fā)現(xiàn)Orexin的分布更為廣泛, 生理功能也多種多樣。Orexin通過其受體發(fā)揮作用, 參與機(jī)體攝食、能量穩(wěn)態(tài)、體溫、睡眠、覺醒周期、生殖、內(nèi)臟活動和內(nèi)分泌等方面的調(diào)節(jié)(Adamantidis & de Lecea, 2008;Matsuki & Sakurai, 2008)。Sakurai et al(1998)也克隆到兩種 Orexin受體：Orexin-1 受體(OX1R)和Orexin-2 受體(OX2R)。前者特異性地與 Orexin-A結(jié)合; 后者則對Orexin-A和Orexin-B沒有選擇性。

目前對 Orexin的研究還主要集中在小鼠等哺乳動物, 近幾年來才開始對魚類進(jìn)行研究。目前只在斜帶石斑魚(Epinephelus coioides) (Zhang, 2006)、金魚(Carassius auratus)(Miura et al, 2007)、大西洋鱈魚(Gadus morhus)(Xu & Volkoff, 2007)和冬鰈(Pleuronectes americanus)(Buckley et al, 2010)中成功克隆出來Orexin前體基因。斑馬魚（Danio rerio）(Kaslin et al, 2004; Faraco et al, 2006)、青鏘（Oryzias latipes） (Faraco et al, 2006)、河豚（Takifugu rubripes） (Faraco et al, 2006)等幾種模式生物憑借其全基因組序列已被測定的優(yōu)勢，也已被預(yù)測出了Orexin序列。同時, 對Orexin攝食調(diào)控的研究也僅僅集中于金魚(Volkoff et al, 1999; Volkoff et al, 2003;Miura et al, 2007)。截至目前, 對養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類攝食調(diào)控的研究還鮮有報道。

鑒于 Orexin在攝食調(diào)控中的重要作用以及尼羅羅非魚的重要經(jīng)濟(jì)價值, 本文從尼羅羅非魚下丘腦中成功克隆出Orexin前體基因的cDNA序列, 并對其組織分布模式以及在攝食調(diào)控中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。這將對進(jìn)一步闡明魚類攝食調(diào)控的分子機(jī)理提供理論依據(jù), 為研制可應(yīng)用于生產(chǎn)的促進(jìn)魚類攝食和生長的新產(chǎn)品打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗用尼羅羅非魚, 均來自廣東省國家級羅非魚良種場(廣州番禺)?？寺『徒M織表達(dá)所用羅非魚體重約500 g, 帶回實驗室, 冰上麻醉, 迅速分離出各腦分區(qū)及外周等18個組織, 用DEPC水快速洗去殘留血液, 立即裝入1.5 mL離心管中, 液氮速凍,然后轉(zhuǎn)入?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

各生理實驗中所用羅非魚平均體重為(73.32±3.54) g, 平均體長為(15.65±1.45) cm, 實驗魚以18～20 ℃循環(huán)過濾水飼養(yǎng), 正常日光。每天中午12：00準(zhǔn)時投喂1.5% BW的飼料, 飼料購自中山統(tǒng)一企業(yè)有限公司, 實驗前至少馴養(yǎng)2周。

Trizol Reagent 、DNase I、SuperScript IIITMRT-PCR 試劑盒、Real-time PCR試劑盒Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG購自Invitrogen(USA)公司; E.Z.N.A 質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒為Omega 公司產(chǎn)品; Ins/AcloneTMPCR Product Cloning Kit 載體連接試劑盒、Taq DNA Polymerase、RevertAidTMH Minus M-MuLV reverse transcriptase kit 購自 Fermentas(USA)公司; PCR所用引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成; 其余均為國產(chǎn)分析純試劑。大腸桿菌(Escherichia coli) DH5α 由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物 根據(jù) NCBI GenBank 中已登錄的哺乳動物、雞、大西洋鱈魚、斑馬魚等物種的Orexin前體基因的cDNA序列保守區(qū)域, 設(shè)計一套用于擴(kuò)增中間片段的簡并引物, 共有兩條上游引物(P1和P2)和一條下游引物(P3)。引物序列見表1。

1.2.2 尼羅羅非魚Orexin前體基因的 cDNA克隆用Trizol法提取尼羅羅非魚下丘腦總RNA, 260 nm下的吸光值衡量RNA的濃度, 然后用0.8%瓊脂糖凝膠, 通過28S和18S條帶的亮度來確定總RNA完整性。按照Invitrogen SuperScript III RT-PCR試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。擴(kuò)增中間片段時, 第一輪以P1和P2為引物。 PCR 反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性3 min , 然后94 ℃變性30 s, 55 ℃退火30 s , 72 ℃延伸 30 s, 40個循環(huán)后 72 ℃延伸 10 min。第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為模板, 進(jìn)行第二輪巢式PCR(Nested PCR), 引物為P2和P3, 反應(yīng)程序同上。

表1 用于尼羅羅非魚Orexin前體基因cDNA克隆和定量PCR所需引物序列Tab. 1 Nucleotide sequences of the primers used for the cDNA of tilapia prepro-orexin and real-time PCR

根據(jù)所獲得中間片段序列設(shè)計特異引物(F1、F2、R1和 R2), 結(jié)合RACE試劑盒接頭引物 AAP和 AUAP, 進(jìn)行 3′-RACE 和 5′-RACE 擴(kuò)增。將擴(kuò)增得到的 PCR產(chǎn)物在 1.5%瓊脂糖凝膠上電泳分離DNA片段, 并在紫外光下回收目的條帶。用E.Z.N.A膠回收試劑盒純化目的產(chǎn)物, 然后亞克隆到PTZ57R/T載體上, 挑選陽性克隆并進(jìn)行測序。

1.2.3 序列分析 將所獲得的3個片段用DNAssist 2.0軟件進(jìn)行拼接。用DNAtools 6.0對開放閱讀框進(jìn)行分析并翻譯成蛋白質(zhì)。運用 SignalP3.0 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/service/SignalP)進(jìn)行信號肽的預(yù)測。運用 Clustalx1.83軟件對多個物種Orexin前體氨基酸序列進(jìn)行比對, 并用DNAstar軟件對各序列的同源性進(jìn)行計算。運用Mega3.1軟件,采用Neighbor-Joining法構(gòu)建脊椎動物Orexin前體蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 尼羅羅非魚Orexin前體基因的組織表達(dá)分析 提取下丘腦(hypothalamus)、垂體(pituitary)、嗅球(olfactory bulb)、脊髓(spinal cord)、端腦(telencephalon)、小腦(cerebellum)、中腦(optic tectum)、延腦(medulla oblongate)、肝臟(liver)、腎臟(kindey)、脾臟(spleen)、脂肪(fat)、頭腎(head kindey)、肌肉(muscle)、胃(stomach)、腸(gut)、心臟(heart)和鰓(gill)等 18個組織總 RNA, 經(jīng) DNase I處理后, 按照《RevertAidTMH Minus M-MuLV reverse transcriptase kit》說明書, 用1 μg RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍作為Real-time PCR反應(yīng)的cDNA模板, 參照《Platinum? SYBR? Green qPCR SuperMix-UDG試劑盒》說明書準(zhǔn)備反應(yīng)體系。Real-time PCR所涉及的引物設(shè)計、質(zhì)粒的濃度梯度制備以及具體測定方法參照Chen et al (2009)進(jìn)行, 具體反應(yīng)程序如下：首先50 ℃反應(yīng)2 min, 緊接著95 ℃ 預(yù)變性3 min, 然后95 ℃預(yù)變性30 s, 55 ℃ 退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共進(jìn)行40個循環(huán), 最后進(jìn)行溶解曲線分析, 以確定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性。為保證結(jié)果的可信性, 進(jìn)行定量PCR反應(yīng)時每個樣品設(shè)置三個平行。

1.2.5 尼羅羅非魚Orexin前體基因在攝食前后的表達(dá)分析 實驗開始前, 所有實驗魚在實驗條件下馴養(yǎng)2周。按照下列時間點對正常喂養(yǎng)下的羅非魚進(jìn)行下丘腦取樣：攝食前2 h (-2 h)、攝食前1 h (-1 h)、攝食中 (0 h)、攝食后1 h (+1 h)和攝食后2 h (+2 h), 每個時間點取8～10條魚, 取樣、RNA提取及定量PCR操作參照前面1.2.4節(jié)方法。

1.2.6 饑餓和再投喂對尼羅羅非魚Orexin前體基因的表達(dá)影響 大約100條實驗魚分成3組：第一組正常投喂組; 第二組饑餓組; 第三組先饑餓 4 d,從第四天開始投喂。實驗魚經(jīng)過2周的馴養(yǎng)后進(jìn)行實驗饑餓處理, 分別在處理后第2、4、6和8天取樣, 取樣時間為投喂后4 h。下丘腦取樣、RNA提取及定量PCR操作參照前面1.2.4節(jié)方法。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 分別以含有Orexin和18SrRNA基因片段的質(zhì)粒濃度梯度所對應(yīng)的 CT值和質(zhì)粒濃度的負(fù)對數(shù)值為坐標(biāo), 做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。將不同樣品中Orexin和18SrRNA基因的表達(dá)量所對應(yīng)的CT值與標(biāo)準(zhǔn)曲線相對照, 即可得到該樣品所測基因表達(dá)量的相對濃度值, 最后以目的基因同內(nèi)參基因的比值來表示目的基因的相對表達(dá)量(target gene/18SrRNA)。

所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SEM)來表示。采用SPSS13.0 (SPSS, Chicago, IL, USA)軟件來分析數(shù)據(jù), 用Duncan's multiple range test來檢測統(tǒng)計差異, 當(dāng)P＜0.05認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 尼羅羅非魚Orexin的cDNA序列及特征

以尼羅羅非魚下丘腦總 RNA為模板, 采用RT-PCR和RACE方法成功克隆出Orexin前體基因cDNA (此序列在 GenBank 數(shù)據(jù)庫的登錄號為：FJ871159)。該cDNA全長648 bp, 其中 5′ 非編碼區(qū)長29 bp, 開放讀碼框423 bp, 3' 非編碼區(qū)長196 bp (圖1)。計算出：尼羅羅非魚Orexin 前體蛋白為140 個氨基酸, 其中包括 37 個氨基酸的信號肽、43 個氨基酸的Orexin-A、28 個氨基酸的 Orexin-B和末尾 32個氨基酸組成的功能不詳?shù)亩嚯摹?/p>

圖1 尼羅羅非魚Orexin前體的全長cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 1 The full-length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of the tilapia prepro-orexin

為了分析 Orexin前體蛋白的結(jié)構(gòu)特征, 運用Clustalx1.83軟件對尼羅羅非魚Orexin前體蛋白與其他物種進(jìn)行了比對(圖2)。結(jié)果顯示, 分別存在于Orexin-A和 Orexin-B末端的兩個保守切割位點GKR 和GRR在羅非魚中同樣保守。與其他脊椎動物一樣, 尼羅羅非魚Orexin-A中同樣存在四個半胱氨酸(Cys), 但是與哺乳動物不同的是它們所處的位置略有差異。在羅非魚中四個半胱氨酸的位置分別是Cys6、Cys7 、Cys14和Cys21, 而在哺乳動物中則分別是 Cys6、Cys7 、Cys12 和 Cys14。另外, 羅非魚Orexin前體蛋白與其他物種一樣, OrexinB的保守度要高于Orexin-A的保守度。同時, Orexin-B后的多肽部分氨基酸變異則較大。

圖2 尼羅羅非魚與其他物種Orexin 前體蛋白的序列比對Fig. 2 Alignment of the amino acid sequences of prepro-orexin among tilapia and other vertebrates

運用DNAStar軟件包中的MegAlign子軟件計算尼羅羅非魚 Orexin前體蛋白與其他物種的同源百分比, 結(jié)果顯示尼羅羅非魚Orexin-A與fugu同源性最高為 81.1%, 而與其他物種則較低, 均在36.4%～69.8%之間; Orexin-B的同源性也是與fugu的同源性最高為 78.6%, 與其他物種的同源性則在53.6%～75%之間。進(jìn)一步應(yīng)用Mega 3.1 軟件構(gòu)建Orexin 前體蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。由進(jìn)化樹可見,Orexin前體蛋白共分為兩大支, 尼羅羅非魚Orexin前體蛋白位于硬骨魚類這一分支上, 且與青鏘、河豚、大西洋鱈魚的關(guān)系較近; 與鯉形目(斑馬魚和金魚)關(guān)系次之; 與哺乳動物的關(guān)系最遠(yuǎn)。這與同源性分析的結(jié)果相一致。

2.2 尼羅羅非魚Orexin前體基因的組織表達(dá)

圖3 脊椎動物Orexin前體蛋白的進(jìn)化樹分析Fig. 3 Phylogenetic tree based upon the alignment of amino acid sequences of vertebrates prepro-orexins

運用 Real-time PCR分別檢測尼羅羅非魚Orexin前體基因在18個組織中的表達(dá)量, 結(jié)果顯示,尼羅羅非魚Orexin前體基因分布廣泛, 在18種組織中均不同程度的檢測到其表達(dá)(圖4)。Orexin前體基因在腦中的表達(dá)量較高, 其中在下丘腦有最高表達(dá)量, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在其他組織中的表達(dá)水平。在外周組織中Orexin前體基因的表達(dá)量則相對較低, 其中以肝臟和肌肉中為最高; 其次是胃和心臟; 而在腸中的表達(dá)量為最低。

圖4 尼羅羅非魚Orexin 前體基因在不同組織中的表達(dá)Fig. 4 Expression of tilapia prepro-orexin mRNA in a variety of tissues

2.3 攝食前后的尼羅羅非魚 Orexin前體基因在下丘腦中的表達(dá)影響

運用Real-time PCR對尼羅羅非魚攝食前后5個時間點Orexin前體基因的表達(dá)量分別進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示與攝食中的Orexin前體基因表達(dá)量相比,攝食前2 h和1 h與攝食后1 h和2 h,Orexin前體基因表達(dá)量均顯著降低(P＜0.05), 表達(dá)量均為攝食狀態(tài)下的50%～70%(圖5)。同時, 從圖中可以看出隨著攝食時間點的臨近,Orexin前體基因的表達(dá)量逐漸升高, 在攝食中達(dá)到最大值。

2.4 饑餓和再投喂對尼羅羅非魚 Orexin前體基因的表達(dá)影響

在饑餓和再投喂實驗中, 把正常組的表達(dá)量設(shè)為1, 其余組均與正常組相比較, 結(jié)果如圖6。尼羅羅非魚分別饑餓2、4、6和8 d后,Orexin前體基因在下丘腦的表達(dá)量與正常投喂組相比均顯著升高(P＜0.05), 其中饑餓4 d后的表達(dá)量達(dá)到最高, 為正常投喂的2.2倍左右; 同時, 饑餓恢復(fù)組在饑餓4 d重新恢復(fù)投喂4 h后,Orexin前體mRNA 表達(dá)量又恢復(fù)至正常水平。

圖5 尼羅羅非魚Orexin前體基因在下丘腦中隨攝食時間的表達(dá)量變化Fig. 5 Peri-prandial changes in tilapia prepro-orexin mRNA expression in hypothalamus

圖6 饑餓和再投喂對尼羅羅非魚Orexin前體基因的表達(dá)的效應(yīng)Fig. 6 Effects of fed and refeeding on the expression of tilapia prepro-orexin mRNA in hypothalamus

3 討 論

本研究運用RT-PCR和RACE技術(shù), 從尼羅羅非魚下丘腦反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物克隆得到了全長為 648 bp的Orexin前體cDNA序列。開放讀碼框為423 bp,編碼140 個氨基酸組成的Orexin 前體蛋白, 含有43個氨基酸的Orexin-A和28 個氨基酸的Orexin-B。同源性分析表明, 在哺乳類和雞中Orexin-A之間的同源性高于 Orexin-B, 而在硬骨魚類中這一結(jié)果則相反。Xu & Volkoff (2007)認(rèn)為在硬骨魚類中Orexin-A的同源性降低與插入的十幾個氨基酸變異程度較大有關(guān)。我們的氨基酸序列比對結(jié)果也證實了這一解釋（見圖2）, 與哺乳類和雞相比, 硬骨魚類Orexin-A插入了12～16個氨基酸(位于哺乳動物Orexin-A的第24與第25個氨基酸之間), 且這些氨基酸序列上沒有同源性。Kane et al (2000)研究發(fā)現(xiàn), 人Orexin-A和Orexin-B的結(jié)構(gòu)類似, 都能夠結(jié)合其受體。盡管Alvarez & Sutcliffe(2002)認(rèn)為這一間隔序列對于 Orexin-A的活性來說可能并不是必要的, 但這些氨基酸的存在對其結(jié)構(gòu)是否有一定的改變, 它們的存在有何意義, 還需要進(jìn)一步研究。

在哺乳類和雞Orexin-A中存在4個位置保守的半胱氨酸(Cys6、Cys7、Cys12和Cys14), 形成兩個內(nèi)部二硫鍵(Cys6-Cys12 和 Cys7-Cys14)維持Orexin-A的穩(wěn)定性和生理功能(Ohno & Sakurai,2008)。然而, 包含尼羅羅非魚在內(nèi)的硬骨魚類中這4個半胱氨酸的位置只有3個是保守的(Cys6、Cys7和 Cys14), 另外一個半胱氨酸(Cys12)位于羅非魚Orexin-A的第21位氨基酸。盡管位置不保守, 但仍可能形成兩個二硫鍵。與Orexin-A相比, Orexin-B不含半胱氨酸, 無法形成二硫鍵, 這可能是Orexin-A促進(jìn)攝食的作用持續(xù)時間長于 Orexin-B的原因之一(Tan et al, 2004)。

本文通過定量PCR發(fā)現(xiàn),Orexin前體基因在尼羅羅非魚腦部特別是下丘腦有較高的表達(dá)量, 這與其他物種的研究結(jié)果相一致。下丘腦外側(cè)區(qū)是經(jīng)典的攝食中樞,Orexin前體mRNA在下丘腦中的表達(dá),說明Orexin有可能參與攝食和能量平衡的調(diào)節(jié), 同時也說明Orexin在種系發(fā)生上具有一定保守性。在被檢測的尼羅羅非魚 10種外周組織中也有不同程度Orexin前體基因的表達(dá), 這一結(jié)果與在其他物種中的表達(dá)模式略有不同。在大西洋鱈魚鰓、皮膚、腎、脾、小腸中檢測到少量Orexin前體基因的表達(dá),但在心臟、肝臟里未見表達(dá)(Xu & Volkoff, 2007)。在斑馬魚心臟、鰓中檢測到Orexin前體基因的表達(dá),而在肝臟、腸及肌肉中均未發(fā)現(xiàn)(Kaslin et al, 2004)。在嚙齒動物中目前僅在腦和心臟中有報道(Johren et al, 2001; Caillol et al, 2003), 但通過放免方法在豬腸和胰腺中檢測到 Orexin-A的分布(Dyer et al,1999; Kirchgessner & Liu, 1999; Kirchgessner,2002)。這些結(jié)果表明,Orexin前體基因在物種間的表達(dá)可能存在一定的差異, 同時,Orexin前體基因在尼羅羅非魚各組織中的廣泛表達(dá)表明其在體內(nèi)可能扮演著多種生理功能, 但具體功能模式和作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

我們的結(jié)果還顯示在攝食狀態(tài)中尼羅羅非魚Orexin前體基因的表達(dá)量較之?dāng)z食前和攝食后均有顯著性提高, 并且隨著攝食時間的臨近表達(dá)量逐漸升高, 這和在大西洋鱈魚中的研究結(jié)果相一致(Xu& Volkoff, 2007)。之前的研究報道也發(fā)現(xiàn)其他調(diào)節(jié)食欲的多肽, 如NPY(Kehoe & Volkoff, 2007)、ghrelin(Unniappan et al, 2004)、CART (Volkoff & Peter,2001)等的表達(dá)量也隨著攝食狀態(tài)的變化而變化。這些結(jié)果預(yù)示著 Orexin可能作為一個攝食信號參與到了尼羅羅非魚的攝食調(diào)控。另外, 攝食1 h和2 h后Orexin的表達(dá)量隨之又顯著降低, 這也表明Orexin可能并不參與攝食后的消化過程, 僅僅是食欲的刺激者。饑餓實驗中, 饑餓不同時間后Orexin的表達(dá)量與正常投喂組相比均顯著升高, 這進(jìn)一步證實了Orexin與羅非魚的攝食調(diào)控密切相關(guān)。同時,饑餓恢復(fù)組在饑餓4 d重新投喂4 h后,Orexin前體mRNA 表達(dá)量又恢復(fù)至正常水平, 這預(yù)示著Orexin對攝食的調(diào)控可能屬于一種短期的的機(jī)制。盡管目前在魚類中還沒有有關(guān)饑餓對Orexin基因表達(dá)影響的報道, 但是Orexin基因表達(dá)對饑餓這一生理狀態(tài)的響應(yīng)與其他攝食刺激因子是一致的, 例如NPY (Kehoe & Volkoff, 2007)和ghrelin (Unniappan et al, 2004); 相反, 相關(guān)抑制攝食的因子則在饑餓狀態(tài)下表達(dá)量下降(Volkoff et al, 2005; Kehoe &Volkoff, 2007)。這些結(jié)果表明, Orexin在尼羅羅非魚攝食調(diào)控中可能有著重要的促進(jìn)作用。

總之, 本文首次克隆了尼羅羅非魚的Orexin前體基因序列并對其結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式進(jìn)行了研究。尼羅羅非魚在下丘腦有最大表達(dá)量, 這與其他脊椎動物類似; 同時, 在被檢測的10種外周組織中也有不同程度Orexin前體基因的表達(dá), 這一結(jié)果與在其他物種中的表達(dá)模式略有不同。隨后, 攝食和饑餓實驗表明,Orexin前體基因mRNA表達(dá)量在攝食后顯著降低, 同時饑餓處理后其表達(dá)量顯著升高, 這些結(jié)果預(yù)示著 Orexin可能是以食欲的刺激者的角色參與到魚類的攝食調(diào)控之中。但是, Orexin刺激魚類攝食的具體調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

Adamantidis A, de Lecea L. 2008. Physiological arousal: A role for hypothalamic systems[J].Cell Mol Life Sci,65(10): 1475-1488.

Alvarez CE, Sutcliffe JG. 2002. Hypocretin is an early member of the incretin gene family[J].Neurosci Lett,324(3): 169-172.

Buckley C, MacDonalda EE, Tuziaka SM, Volkoff H. 2010. Molecular cloning and characterization of two putative appetite regulators in winter flounder (Pleuronectes americanus): Preprothyrotropin-releasing hormone (TRH) and prepro-orexin (OX)[J].Peptides, 2010, 31(9):1737-1747.

Caillol M, Aioun J, Baly C, Persuy MA, Salesse R. 2003. Localization of orexins and their receptors in the rat olfactory system: Possible modulation of olfactory perception by a neuropeptide synthetized centrally or locally[J].Brain Res,960(1-2): 48-61.

Chen WB, Li WS, Lin HR. 2009. Common carp (Cyprinus carpio)insulin-like growth factor binding protein-2 (IGFBP-2): molecular cloning, expression profiles, and hormonal regulation in hepatocytes[J].Gen Comp Endocrinol,161(3): 390-399.

Dyer CJ, Touchette KJ, Carroll JA, Allee GL, Matteri RL. 1999. Cloning of porcine prepro-orexin cDNA and effects of an intramuscular injection of synthetic porcine Orexin-B on feed intake in young pigs[J].Domest Anim Endocrinol,16(3): 145-148.

de Lecea L, Kilduff TS, Peyron C, Gao X, Foye PE, Danielson PE,Fukuhara C, Battenberg EL, Gautvik VT, Bartlett FS, 2nd, Frankel WN,van den Pol AN, Bloom FE, Gautvik KM, Sutcliffe JG. 1998. The hypocretins:hypothalamus-specific peptides with neuroexcitatory activity[J].Proc Natl Acad Sci USA,95(1): 322-327.

Faraco JH, Appelbaum L, Marin W, Gaus SE, Mourrain P, Mignot E. 2006.Regulation of hypocretin (Orexin) expression in embryonic zebrafish[J].J Biol Chem,281(40): 29753-29761.

Johren O, Neidert SJ, Kummer M, Dendorfer A, Dominiak P. 2001.Prepro-orexin and orexin receptor mRNAs are differentially expressed in peripheral tissues of male and female rats[J].Endocrinology,142(8):3324-3331.

Kane JK, Parker SL, Matta SG, Fu Y, Sharp BM, Li MD. 2000. Nicotine up-regulates expression of orexin and its receptors in rat brain[J].Endocrinology,141(10): 3623-3629.

Kaslin J, Nystedt JM, Ostergard M, Peitsaro N, Panula P. 2004. The orexin/hypocretin system in zebrafish is connected to the aminergic and cholinergic systems[J].J Neurosci,24(11): 2678-2689.

Kirchgessner AL. 2002. Orexins in the brain-gut axis[J].Endocr Rev,23(1):1-15.

Kirchgessner AL, Liu M. 1999. Orexin synthesis and response in the gut[J].Neuron,24(4): 941-951.

Kehoe AS, Volkoff H. 2007. Cloning and characterization of neuropeptide Y(NPY) and cocaine and amphetamine regulated transcript (CART) in Atlantic cod (Gadus morhua)[J].Comp Biochem Physiol A:Mol Integr Physiol,146(3): 451-461.

Matsuki T, Sakurai T. 2008. Orexins and orexin receptors: From molecules to integrative physiology[J].Results Probl Cell Differ,46: 27-55.

Miura T, Maruyama K, Shimakura S, Kaiya H, Uchiyama M, Kangawa K,Shioda S, Matsuda K. 2007. Regulation of food intake in the goldfish by interaction between ghrelin and orexin[J].Peptides,28(6): 1207-1213.

Ohno K, Sakurai T. 2008. Orexin neuronal circuitry: role in the regulation of sleep and wakefulness[J].Front Neuroendocrinol,29(1): 70-87.

Sakurai T, Amemiya A, Ishii M, Matsuzaki I, Chemelli RM, Tanaka H,Williams SC, Richardson JA, Kozlowski GP, Wilson S, Arch JR,Buckingham RE, Haynes AC, Carr SA, Annan RS, McNulty DE, Liu WS, Terrett JA, Elshourbagy NA, Bergsma DJ, Yanagisawa M. 1998.Orexins and orexin receptors: a family of hypothalamic neuropeptides and G protein-coupled receptors that regulate feeding behavior[J].Cell,92(4): 573-585.

Tan XM, Chen DW, Yang YF. 2004. Orexin and its physiological functions[J].Chn Feed, 14: 2-7 [譚雪梅, 陳代文, 羊云飛. 增食欲素及其生理功能. 中國飼料, 2004, 14: 2-7]

Xu M, Volkoff H. 2007. Molecular characterization of prepro-orexin in Atlantic cod (Gadus morhua): cloning, localization, developmental profile and role in food intake regulation[J].Mol Cell Endocrinol,271(1-2): 28-37.

Unniappan S, Canosa LF, Peter RE. 2004. Orexigenic actions of ghrelin in goldfish: Feeding-induced changes in brain and gut mRNA expression and serum levels, and responses to central and peripheral injections[J].Neuroendocrinology,79(2): 100-108.

Volkoff H, Canosa LF, Unniappan S, Cerda-Reverter JM, Bernier NJ, Kelly SP, Peter RE. 2005. Neuropeptides and the control of food intake in fish[J].Gen Comp Endocrinol, 142(1-2): 3-19.

Volkoff H, Peter RE. 2001. Characterization of two forms of cocaine- and amphetamine-regulated transcript (CART) peptide precursors in g488 oldfish: molecular cloning and distribution, modulation of expression by nutritional status, and interactions with leptin[J].Endocrinology,142(12): 5076-5088.

Volkoff H, Eykelbosh AJ, Peter RE. 2003. Role of leptin in the control of feeding of goldfishCarassius auratus: Interactions with cholecystokinin,neuropeptide Y and Orexin A, and modulation by fasting[J].Brain Res,972(1-2): 90-109.

Volkoff H, Bjorklund JM, Peter RE. 1999. Stimulation of feeding behavior and food consumption in the goldfish,Carassius auratus, by Orexin-A and Orexin-B[J].Brain Res,846(2): 204-209.

Zhang LJ.2006.Prepro-orexin of Orange-spotted Grouper,Epinephelus coioides: Molecular Cloning and Characteristics of mRNA Expression[D]. Guanzhou: Sun Yet-sen University.

Molecular cloning, tissue distribution and the expression in the regulation of food intake of prepro-orexin in Nile tilapia (Oreochromis niloticus)

CHEN Wen-Bo1,2,#,WANG Xin1,#,ZHOU Ya-Lu1,DONG Hai-Yan1, LIN Hao-Ran1, LI Wen-Sheng1,*

(1.State Key Laboratory of Biocontrol, Institute of Aquatic Economic Animals and Guangdong Provincial Key Laboratory for Aquatic Economic Animals,School of Life Sciences,Sun Yat-Sen University,Guangzhou510275,China; 2.Department of Biology, School of Resources and Environment,Henan Polytechnic University,Jiaozuo454000,China)

We cloned the full length of tilapia prepro-orexin cDNA using RT-PCR and rapid-amplification of cDNA ends (RACE). The full-length of prepro-orexin cDNA was 648 bp containing an open reading frame of 423 bp. The 140 amino acid prepro-orexin protein included a 37 AA signal peptide, a 43 AA Orexin-A and, and 28 AA Orexin-B and the end of the 32 AA peptide of unknown function. The expression of prepro-orexin on tissue distribution, peri-prandial changes, starvation and re-feeding were quantified by real-time PCR. We found that prepro-orexin mRNA was present in all tissues tested and that the highest level was observed in hypothalamus. Expression levels were significantly higher at mealtime (0 h) than before (?2 h, ?1 h) and after (+1 h, +2 h) mealtime. Fasting for 2, 4, 6 and 8 d caused significant increases in prepro-orexin mRNA expression in the hypothalamus, and after re-feeding, expression levels of prepro-o rexin mRNA returned to the same level compared to that in the fed group.

Nile tilapia (Oreochromis niloticus);Orexin; Cloning; Expression; Food intake

Q78; Q959.483

A

0254-5853-(2011)03-0285-08

10.3724/SP.J.1141.2011.03285

2010-09-13；接受日期：2011-02-21

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金項目(CARS-49); 2007年公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費項目(3-49-10);“863”專題項目(2007AA10Z165)

?通訊作者(Corresponding author)，李文笙(1967—), 女, 漢族, 博士, 教授, 主要從事魚類生理和分子生物學(xué)、神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)研究。E-mail：lsslws@mail.sysu.edu.cn

#共同第一作者, 陳文波(1982—), 男, 博士, 講師, 從事魚類生理學(xué)和分子生物學(xué)研究, E-mail：chenwenbo@hpu.edu.cn; 王鑫(1987—), 男, 碩士研究生