• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    以梭魚(yú)金屬硫蛋白基因表達(dá)監(jiān)測(cè)海洋重金屬污染

    2011-12-21 00:49:38安立會(huì)鄭丙輝趙興茹尚晶晶中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家環(huán)境保護(hù)河口與海岸帶重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京100012
    中國(guó)環(huán)境科學(xué) 2011年8期
    關(guān)鍵詞:梭魚(yú)定量重金屬

    安立會(huì),鄭丙輝,付 青,趙興茹,尚晶晶,張 雷 (中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院,環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家環(huán)境保護(hù)河口與海岸帶重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100012)

    以梭魚(yú)金屬硫蛋白基因表達(dá)監(jiān)測(cè)海洋重金屬污染

    安立會(huì)*,鄭丙輝,付 青,趙興茹,尚晶晶,張 雷 (中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院,環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家環(huán)境保護(hù)河口與海岸帶重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100012)

    分離了梭魚(yú)金屬硫蛋白132個(gè)堿基對(duì)應(yīng)44個(gè)氨基酸的部分基因序列,以此為基礎(chǔ)建立了分析梭魚(yú)金屬硫蛋白基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR方法,并用于分析渤海南戴河和大神堂近岸海域野生梭魚(yú)金屬硫蛋白基因的表達(dá).結(jié)果表明,南戴河野生梭魚(yú)金屬硫蛋白基因的表達(dá)水平(雄魚(yú):0.012 ± 0.0064 copies/copy β-actin;雌魚(yú):0.0099 ± 0.0042 copies/copy β-actin)明顯高于大神堂野生梭魚(yú)的表達(dá)水平(雄魚(yú):0.0017± 0.0011 copies/copy β-actin;雌魚(yú):0.0014 ± 0.00095 copies/copy β-actin).該結(jié)果與兩地野生梭魚(yú)體內(nèi)重金屬殘留水平相一致,提示梭魚(yú)金屬硫蛋白基因可作為監(jiān)測(cè)海洋重金屬污染的敏感標(biāo)志物之一.

    梭魚(yú);金屬硫蛋白mRNA;實(shí)時(shí)定量PCR;重金屬

    金屬硫蛋白是一種廣泛存在于動(dòng)物、植物以及微生物體內(nèi)的低分子量、富含半胱氨酸的蛋白質(zhì).它能夠與重金屬結(jié)合,調(diào)節(jié)生物體內(nèi)必需重金屬(如鋅和銅)的生理功能,并對(duì)非必需重金屬(如鎘和鉛)進(jìn)行脫毒.盡管生物體內(nèi)金屬硫蛋白的表達(dá)會(huì)受到多種因素的影響,但重金屬仍然是其最強(qiáng)誘導(dǎo)劑.近年,金屬硫蛋白作為監(jiān)測(cè)水環(huán)境重金屬污染的一個(gè)重要標(biāo)志物,已經(jīng)得到廣泛關(guān)注

    [1-4].隨著分子生物學(xué)等新興技術(shù)手段在環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用,不同生物的金屬硫蛋白基因序列被相繼克隆,這為從基因表達(dá)水平上更加及時(shí)、準(zhǔn)確反映環(huán)境重金屬的污染狀況提供了可靠技術(shù)手段[5-10].目前用于分析金屬硫蛋白基因表達(dá)水平的方法主要有Northern 雜交[11]、半定量聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)[12]和實(shí)時(shí)定量PCR[13],其中實(shí)時(shí)定量PCR被認(rèn)為是靈敏度最高的一種分析方法[14-15].

    梭魚(yú)是我國(guó)海洋近岸廣泛分布的一種野生魚(yú)類,主要攝食浮游生物和底泥中的有機(jī)質(zhì),并且洄游半徑短,體內(nèi)的污染水平能夠反映棲息環(huán)境的污染狀況.本研究通過(guò)克隆梭魚(yú)的金屬硫蛋白基因序列,建立了分析金屬硫蛋白的實(shí)時(shí)定量PCR分析方法,并對(duì)渤海近岸野生梭魚(yú)體內(nèi)金屬硫蛋白基因表達(dá)水平和重金屬水平進(jìn)行了分析.

    1 材料與方法

    1.1 樣品采集

    利用潮汐水位差布設(shè)地撩網(wǎng),在南戴河(39°43'31.03"N, 119°24'48.17"E)和 大 神 堂(39°10'41.66"N, 117°57'52.79"E)近岸海域捕獲野生梭魚(yú)(Liza Haematocheila)(圖1).選取規(guī)格相似[南戴河站點(diǎn):平均體重為(177.03 ± 45.84) g,平均體長(zhǎng)為(25.5 ± 2.2)cm;大神堂站點(diǎn):平均體重為(104.01 ± 76.89) g,平均體長(zhǎng)為(20.1 ± 4.9) cm]、體表無(wú)傷、健康鮮活的梭魚(yú)(樣本數(shù)n > 10),擊打頭部致昏.現(xiàn)場(chǎng)立即解剖摘取部分肝臟置于液氮中凍存以用于分析金屬硫蛋白基因表達(dá)水平,剪取性腺置于10%中性甲醛中固定,以做組織切片,區(qū)分雌雄.同時(shí)取部分肌肉置于低溫保溫箱內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室分析重金屬.

    圖1 野生梭魚(yú)捕獲布設(shè)地示意Fig 1 Sampling sites for collecting the redeye mullets from Bohai Bay, north of China

    1.2 實(shí)時(shí)定量PCR分析野生梭魚(yú)金屬硫蛋白基因

    分取液氮凍存的梭魚(yú)肝組織約20~30mg(每點(diǎn)雌雄各5尾),利用Trizol試劑提取總RNA[16].經(jīng)紫外和電泳檢測(cè)分析 RNA濃度和質(zhì)量后(A260/280> 1.8),逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA:取約100ng 的總 RNA, 0.5mmol/L dNTPs (Takara Ltd,大連),2.5μmol/L Oligo(dT)18(Invitrogen Ltd, USA)和200 units SuperScript III RT (Invitrogen Ltd, USA),反應(yīng)體積為 5μL.一個(gè)管內(nèi)不加樣品 RNA以作為陰性對(duì)照.混合液按照SuperScript III RT試劑說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈.

    利用Bioedit 7.0.0軟件比對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的其它生物金屬硫蛋白基因序列(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov),利用 Primer Premier 5.0在保守序列部分設(shè)計(jì)兼并引物:Forward primer: 5’-CGGGATCCATGGA(c,t)CC(c,t)TG(c,t)GA(a, g,t)TGC(g,t)C(c,t)AA-3’, Reverse primer: 5’-GGAATTCTT(a,g)CACAC(a,g)CAGCC(a,t)CA(a,g) GC(a,g)CA-3’.以上述合成的cDNA第一鏈為模板,利用 MyCyclerTMPCR儀(BioRad, USA)在下列條件下擴(kuò)增梭魚(yú)金屬硫蛋白基因:95℃,2min,1個(gè)循環(huán);95℃,30s;55℃,45s,72℃,60s,40個(gè)循環(huán);最后在72℃條件下延伸6min.反應(yīng)總體積為50μL.所得擴(kuò)增產(chǎn)物在 1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳和EB染色,在紫外照射條件下切下目的條帶回收、純化,送至大連寶生物公司測(cè)序.

    利用 BLAST(hhtp://www.ncbi.nlm.nih.gov /BLAST/)在線比對(duì)所得序列.在證實(shí)所得序列即為金屬硫蛋白基因序列后,利用 Primer Express 2.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR的特異引物(Forward primer: 5’-ATGGACCCTTGTGATTGC-3’;Reverse primer: 5’-CAGATGGGCAGCATGAGC-3’). PCR反應(yīng)混合液包括SYBR Green PCR Master Mix 10μL,正向和反向引物各 0.2μL(20μmol/L),樣品cNDA模板5μL,加滅菌的蒸餾水補(bǔ)足至20μL.擴(kuò)增條件為:50℃保持 2min,95℃保持 10min,然后95℃,15s,60℃,1min,40循環(huán)(ABI Prism? 7000, USA).在最后1個(gè)循環(huán)結(jié)束后做溶解曲線驗(yàn)證引物的特異性.以純化的金屬硫蛋白普通PCR產(chǎn)物作為cDNA標(biāo)準(zhǔn)品建立定量標(biāo)準(zhǔn)曲線,以β-actin (No.EF638008)為內(nèi)參基因?qū)饘倭虻鞍谆虻谋磉_(dá)水平進(jìn)行定量.

    1.3 野生梭魚(yú)體內(nèi)重金屬分析

    為了揭示誘導(dǎo)金屬硫蛋白表達(dá)的可能誘導(dǎo)劑,同時(shí)分析了魚(yú)體的重金屬水平.取凍存的梭魚(yú)部分肌肉組織(每點(diǎn)各10尾),去表皮和肌尖刺后置于超純水(電導(dǎo)率:18.0?/cm)中高速勻漿,然后將所得肉糜冷凍干燥(-40℃)至恒重.精確稱取0.1000g凍干的肌肉組織粉末,加入 5Ml HNO3(65.0%,CNW,德國(guó))和 3mL HF(40%, MERCK,德國(guó)),輕輕震蕩混勻后置于微波消解儀(MARS, CEM, USA)進(jìn)行消解:溫度在起始5min內(nèi)上升至120℃并持續(xù)1min,然后在5min內(nèi)上升至160℃并持續(xù)3min,最后在7min內(nèi)上升至180℃并持續(xù)10min,然后靜置至室溫.消解液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯燒杯中,置于電熱板上加熱去除殘酸.然后將樣品液轉(zhuǎn)移至 100mL的容量瓶中,用2% HNO3洗滌聚四氟乙烯杯3~4次,合并洗液定容、搖勻備用分析重金屬元素.按同樣的方法做試劑空白.利用 ICP-MS(Agilent 7500)測(cè)定消解樣品中As、Cd、Cr、Mn、Ni、Cu、Pb和Zn,以Sc、Ge、Rh、In、Tb、Lu和Bi作為在線內(nèi)標(biāo)(Agilent Part Number: 5188-6525)進(jìn)行定量.

    最后,根據(jù)梭魚(yú)體內(nèi)重金屬含量計(jì)算重金屬殘留量指數(shù)(I),采用均值型綜合污染指數(shù)法[17]對(duì)兩個(gè)地點(diǎn)野生梭魚(yú)重金屬污染狀況進(jìn)行了評(píng)價(jià).

    式中: Ci為魚(yú)體內(nèi) i類重金屬殘留量,即實(shí)測(cè)值, mg/kg;Cs,i為 i類重金屬允許殘留量 mg/kg.其中,As、Cd、Cr、Cu和 Pb的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)按照 NY 5073-2001《無(wú)公害食品 水產(chǎn)品中有毒有害物質(zhì)限量》[18](分別為0.5,0.1,2.0,50和0.5mg/kg)計(jì)算;Zn按照 GB13106-1991《食品中鋅限量標(biāo)準(zhǔn)》[19](50mg/kg)計(jì)算;由于目前食品上還沒(méi)有 Mn和 Ni的限量標(biāo)準(zhǔn),因此 Mn和 Ni不計(jì)入.結(jié)合相關(guān)研究

    [20-21],污染程度采樣以下劃分標(biāo)準(zhǔn):污染綜合指數(shù)均值<0.2視為正常背景水平,0.2~<0.6為輕污染水平,0.6~<1.0污染水平,≥1.0則視為重污染水平.

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    采用SPSS 11.0軟件的One-way ANOVA 和Turkey 多重比較來(lái)檢驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)的差異.當(dāng)P <0.05 時(shí)認(rèn)為差異顯著.所有數(shù)據(jù)和圖表均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示.

    2 結(jié)果

    2.1 梭魚(yú)金屬硫蛋白基因分離、測(cè)序與鑒定

    圖2 利用兼并引物擴(kuò)增梭魚(yú)金屬硫蛋白基因部分序列Fig.2 Partial nucleotide and protein of the redeye mullet (Liza haematocheila) MT gene. The numbers above the sequence indicate the nucleotide position

    利用設(shè)計(jì)的兼并引物,分離了梭魚(yú)肝組織cDNA擴(kuò)增后片段,經(jīng)測(cè)序獲得132個(gè)堿基,根據(jù)三聯(lián)體密碼子對(duì)應(yīng)著 44個(gè)氨基酸(圖 2).通過(guò)BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)在線比對(duì)確認(rèn)為金屬硫蛋白基因,將所得序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(No.: FJ827633).經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)登記的其他物種金屬硫蛋白比對(duì),本研究擴(kuò)增的梭魚(yú)金屬硫蛋白基因?qū)儆?MT-I型,并與斑點(diǎn)鮭魚(yú)(Oncorhynchus gorbuscha, ABA03251)和歐洲鰈 (Pleuronectes platessa, CAA40067)具有 86%相似性,與北極紅點(diǎn)鮭(Salvelinus alpines, AAP31403) 具有 82%的相似性,與鯽魚(yú)(Carassius auratus, AAB32777)具有79%的相似性(圖3).

    圖3 梭魚(yú)金屬硫蛋白基因部分氨基酸序列與斑點(diǎn)鮭魚(yú)(Oncorhynchus gorbuscha, ABA03251)、歐洲鰈(Pleuronectes platessa, CAA40067)、北極紅點(diǎn)鮭(Salvelinus alpines, AAP31403)、鯽魚(yú)(Carassius auratus, AAB32777)氨基酸序列比對(duì)Fig.3 Multiple sequence alignment of the partial amino acid sequence of redeye mullet MT with Oncorhynchus gorbuscha (ABA03251), Salvelinus alpinus (AAP31403), Pleuronectes platessa (CAA40067) and Carassius auratus (AAB32777)

    2.2 梭魚(yú)金屬硫蛋白實(shí)時(shí)定量PCR建立與應(yīng)用

    根據(jù)測(cè)序所得目標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)特異引物,經(jīng)溶解曲線證實(shí)設(shè)計(jì)引物的特異性.以金屬硫蛋白普通 PCR產(chǎn)物做標(biāo)準(zhǔn)品建立定量曲線,cDNA濃度范圍在104~1010copies/mL之間時(shí)拷貝數(shù)與 Ct值之間具有良好的線性關(guān)系(R2= 0.999).

    圖4 實(shí)時(shí)定量PCR分析南戴河和大神堂野生梭魚(yú)肝組織中金屬硫蛋白表達(dá)水平Fig.4 Quantification of MT mRNA in redeye mullet (Liza haematocheila) from Nandaihe and Dashentang

    將建立的金屬硫蛋白實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)野生梭魚(yú)肝組織中金屬硫蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行定量.如圖4可知,南戴河野生梭魚(yú)體內(nèi)金屬硫蛋白的表達(dá)水平(雄魚(yú) n = 5:0.012±0.0064 copies/ copy β-actin,雌魚(yú) n = 5:0.0099 ± 0.0042 copies/ copy β-actin)明顯高于大神堂野生梭魚(yú)的表達(dá)水平(雄魚(yú) n = 5:0.0017±0.0011 copies/copy β-actin,雌魚(yú) n = 5:0.0014 ± 0.00095 copies/copy β-actin) (P < 0.05).并且同一地點(diǎn)的雌雄梭魚(yú)肝組織中金屬硫蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異(P > 0.05).

    2.3 野生梭魚(yú)體內(nèi)重金屬水平分析

    在南戴河和大神堂捕獲的野生梭魚(yú)體內(nèi)均檢測(cè)到多種重金屬元素(表1).其中,Zn的含量最高,Pb含量最低.在所檢出梭魚(yú)體內(nèi)的重金屬中,只有Pb的濃度是大神堂高于南戴河,其他重金屬均是南戴河較大神堂略高,而 Cd在兩處野生梭魚(yú)肌肉中均沒(méi)有檢出.與底棲蝦虎魚(yú)[22]相比,梭魚(yú)體內(nèi)重金屬水平均偏低,這可能與梭魚(yú)是中上層、主要以浮游生物為食的雜食性魚(yú)類,而蝦虎魚(yú)則是底棲、主要以動(dòng)物食物為主的肉食性魚(yú)類有關(guān)[23].由表 1數(shù)據(jù)以及梭魚(yú)肌肉含水率(81.62%±1.85%),換算可得野生梭魚(yú)體內(nèi)重金屬含量(濕重).根據(jù)國(guó)家無(wú)公害食品水產(chǎn)品中有毒有害物質(zhì)限量NY5073-2001[18],南戴河野生梭魚(yú)[Cr(2.19±0.19)mg/kg(濕重)]和 As含量[(1.83%± 0.06%)mg/kg(濕重)]明顯超標(biāo),而大神堂野生梭魚(yú)重金屬則沒(méi)有超標(biāo)現(xiàn)象,這說(shuō)明該水域野生梭魚(yú)重金屬污染對(duì)食用人群具有潛在風(fēng)險(xiǎn).

    根據(jù)梭魚(yú)體內(nèi)重金屬含量(干重)和梭魚(yú)肌肉含水率(81.62%±1.85%),計(jì)算南戴河和大神堂兩地野生梭魚(yú)各種重金屬的魚(yú)體殘留量指數(shù)(I),并取其均值作為綜合污染指數(shù)(表 2),用于評(píng)價(jià)各種重金屬對(duì)梭魚(yú)的綜合污染程度.根據(jù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),南戴河的綜合污染指數(shù)均值為 3.93,屬于污染水平,主要貢獻(xiàn)因此為Cr(1.09)和As(3.70);而大神堂的綜合污染指數(shù)均值為 0.29,屬于輕污染水平,這與兩地野生梭魚(yú)金屬硫蛋白基因表達(dá)水平一致.

    表1 野生梭魚(yú)體內(nèi)重金屬元素含量[μg/g(干重)]Table 1 Heavy metals concentrations in tissues in redeye mullets from Nandaihe and Dashentang using ICP-MS [μg/g(dry weight)]

    表2 野生梭魚(yú)體內(nèi)重金屬殘留量指數(shù)與均值綜合污染指數(shù)Table 2 Heavy metals residue index and mean of synthetical pollution index in redeye mullets from Nandaihe and Dashentang

    研究發(fā)現(xiàn),除了蝶科魚(yú)類(Pleuronectid fishes)[24-25],大多數(shù)魚(yú)類金屬硫蛋白都有 I和 II兩種亞型,對(duì)應(yīng)MT-I和MT-II兩種基因亞型.并且,不同金屬硫蛋白亞型對(duì)不同重金屬有著不同的結(jié)合能力[26-27],如MT-I對(duì)Zn和Cd具有很強(qiáng)的結(jié)合能力,MT-II則對(duì) Cu具有很強(qiáng)的結(jié)合能力

    [28].野外調(diào)查也發(fā)現(xiàn)在一些野生魚(yú)類體內(nèi)金屬硫蛋白的水平與重金屬水平尤其是 Cd、Zn和Cu三種重金屬污染程度呈一定的相關(guān)性[29-31].本研究在南戴河和大神堂梭魚(yú)肌肉組織中都有檢出了Zn和Cu,表明Zn和Cu尤其是Zn對(duì)本研究擴(kuò)增的梭魚(yú)金屬硫蛋白基因(MT-I)表達(dá)具有一定的誘導(dǎo)作用.本研究中在兩地野生梭魚(yú)肌肉組織中均沒(méi)有檢出Cd,這可能是由于Cd在環(huán)境非生物介質(zhì)中含量較低[32],并且魚(yú)類通過(guò)鰓和腸攝入 Cd后主要累積在肝和腎臟組織[33],只有少量重金屬會(huì)轉(zhuǎn)移到肌肉組織,但由于 Cd對(duì)魚(yú)類 MT-I要比對(duì) MT-II具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)能力

    [1,34-35],因此環(huán)境低水平的Cd以及其他重金屬也會(huì)對(duì)梭魚(yú)肝組織金屬硫蛋白基因(MT-I)具有一定的誘導(dǎo)作用.

    在生物體內(nèi),重金屬水平與金屬硫蛋白的蛋白和基因表達(dá)水平之間存在典型的倒“U”型關(guān)系[36-38],即當(dāng)重金屬低于某一濃度閾值時(shí),金屬硫蛋白會(huì)隨著重金屬劑量增加而上升;而一旦超出濃度閾值,重金屬就會(huì)對(duì)生物產(chǎn)生不可逆毒性,金屬硫蛋白水平就會(huì)隨著重金屬水平增加而降低.從以上分析結(jié)果可以看出,盡管南戴河和大神堂野生梭魚(yú)體內(nèi)重金屬化學(xué)水平?jīng)]有顯著差異,但南戴河野生梭魚(yú)肝組織金屬硫蛋白基因表達(dá)水平卻明顯高于大神堂的野生梭魚(yú).如果以大神堂海域重金屬水平為對(duì)照值,兩地野生梭魚(yú)體內(nèi)重金屬殘留水平無(wú)顯著差異,但金屬硫蛋白基因表達(dá)水平的差異說(shuō)明南戴河海域重金屬污染已經(jīng)對(duì)野生梭魚(yú)產(chǎn)生輕微影響,但沒(méi)有超出可產(chǎn)生生物毒性的濃度閾值,這就說(shuō)明化學(xué)水平上的不顯著差異無(wú)法準(zhǔn)確反映污染的綜合效應(yīng)差異.另外,環(huán)境中重金屬對(duì)生物的影響還會(huì)受到多種環(huán)境因子如溫度、鹽度、硬度和生物因子如個(gè)體大小、年齡、生理狀態(tài)的影響,重金屬的不同形態(tài)和價(jià)態(tài)也會(huì)影響重金屬的生物毒性.因此,僅憑環(huán)境重金屬的化學(xué)水平還難以準(zhǔn)確反映重金屬的實(shí)際毒理效應(yīng),而金屬硫蛋白作為一個(gè)生物標(biāo)志物在一定程度上可以用于指示環(huán)境中重金屬污染的復(fù)合效應(yīng).

    3 結(jié)語(yǔ)

    本研究發(fā)現(xiàn)野生梭魚(yú)金屬硫蛋白的基因表達(dá)水平更能反映南戴河附近海域重金屬污染程度高于大神堂附近海域,提示梭魚(yú)金屬硫蛋白基因可作為監(jiān)測(cè)海洋重金屬污染的敏感標(biāo)志物之一.

    [1] Quirós L, Pin? B, Solé M, et al. Environmental monitoring by gene expression biomarkers in barbus graellsii: laboratory and field studies [J]. Chemosphere, 2007,67:1144-1154.

    [2] Chan K M. Concentrations of copper, zinc, cadmium, and lead in Rabbit fish (Siganus oramin) collected in Victoria Harbour, Hong Kong [J]. Mar. Pollut. Bull., 1995,31(4-12):411-415.

    [3] Nikpour Y, Zolgharnein H, Sinaei M, et al. Evaluation of Metallothionein Expression as a Biomarker of Mercury Exposure in Scatophagus argus [J]. Pak. J. Biol. Sci., 2008,11:2269-2273. [4] Pederson S N, Lundebye A K, Depledge M H. Field application of metallothionein and stress protein biomarkers in the shore crab (Carcinus maenas) exposed to trace metals [J]. Aquat. Toxicol., 1997,37:183-200.

    [5] Tom M, Moran O, Jakubov E, et al. Molecular characterization of metallothionein-cDNA of Sparus aurata used for detecting heavy metal pollution along the Mediterranean coast of Israel [J]. Mar. Pollut. Bull., 1998,36:131-137.

    [6] Hylland K, Nissen-Lie T, Christensen P G, et al. Natural modulation of hepatic metallothionein and cytochrome P4501A in flounder, Platichthys flesus L. [J]. Mar. Environ. Res., 1998,46: 51-55.

    [7] Mitsuo R, Itakura T, Sato M. Cloning and Sequencing of Cytochrome P450 1A Complementary DNA in Eel (Anguilla japonica) [J]. Mar. Biotechnol., 1999,1:353-358.

    [8] Ren H W, Itoh N, Kanekiyo M. Two metallothioneins in the fresh-water fish, crucian carp (Carassius cuvieri): cDNA cloning and assignment of their expression isoforms [J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2000,23:145-148.

    [9] Ryu J, Lee M S, Na J G, et al. Molecular cloning of cytochrome P4501A cDNA of medaka (Oryzias latipes) and messenger ribonucleic acid regulation by environmental pollutants [J]. Environ. Toxicol. Chem., 2004,23:1004-1011.

    [10] Kim C I, Kim Y J, Yoon Y D, et al. Cloning of cytochrome P450 1A (CYP1A) genes from the hermaphrodite fish Rivulus marmoratus and the Japanese medaka Oryzias latipes [J]. Mar. Environ. Res., 2004,58:125-129.

    [11] Carginale V, Scudeiro R, Capasso C, et al. Cadmium-induced differential accumulation of metallothionein isoforms in the Antarctic icefish,which exhibits no basal metallothionein protein but high endogenous mRNA levels [J]. Biochem. J., 1998,332: 475-481.

    [12] Hayes R A, Regondi S, Winter M J, et al. Cloning of a chub metallothionein cDNA and development of competitive RT-PCR of chub metallothionein mRNA as a potential biomarker of heavy metal exposure [J]. Mar. Environ. Res., 2004,58: 665-669.

    [13] Werner J, Palace V, Baron C, et al. A real-time PCR method for the quantification of the two isoforms of metallothionein in Lake Trout (Salvelinus namaycush) [J]. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 2008,54:84-91.

    [14] Kaplan L A E, Van Cleef K, Wirgin I, et al. A comparison of RT-PCR and Northern blot analysis in quantifying metallothionein mRNA levels in killifish exposed to waterborne cadmium [J]. Mar. Environ. Res., 1995, 39:137-141.

    [15] Evans C W, Wilson D A, Mills G N. Quantitative competitive RT-PCR as a tool in biomarker analysis [J]. Biomarkers, 2001, 6(1):7-14.

    [16] An L H, Hu J Y, Zhang Z B, et al. Quantitative real-time RT-PCR for determination of vitellogenin mRNA in so-iuy mullet (Mugil soiuy) [J]. Anal. Bioanal. Chem., 2006,386:1995-2001.

    [17] 楊婉玲,賴子尼,魏泰莉,等.北江清遠(yuǎn)段水產(chǎn)品中鉛含量調(diào)查[J]. 淡水漁業(yè), 2007,37(3):67-69.

    [18] NY 5073-2001 無(wú)公害食品 水產(chǎn)品中有毒有害物質(zhì)限量[S].

    [19] GB 13106-1991 食品中鋅限量標(biāo)準(zhǔn) [S].

    [20] 賈曉平,林 欽,李純厚,等.廣東沿海牡蠣體Pb含量水平及時(shí)空變化趨勢(shì) [J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2000,24 (6):527-532.

    [21] 魏泰莉,楊婉玲,賴子尼,等.珠江口水域魚(yú)蝦類重金屬殘留的調(diào)查 [J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2002,9(2):172-176.

    [22] 安立會(huì),鄭丙輝,張 雷,等.渤海灣河口沉積物重金屬污染及潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià) [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2010,30(5):666-670.

    [23] Culioli J L, Fouquoire A, Calendini S, et al. Trophic transfer of arsenic and antimony in a freshwater ecosystem: A field study [J]. Aquatic Toxicology, 2009,94:286-293.

    [24] George S G, Todd K, Wright J. Regulation of metallothionein in telesosts: induction of MT mRNA and protein by cadmium in hepatic and extrahepatic tissues of marine flatfish, the turbot (Scophthalmus maximus) [J]. Comp. Biochem. Physiol. C, 1996,113:109-115.

    [25] George S G, Gubbins M, MacIntosh A, et al. A comparison of pollutant biomarker responses with transcriptional responses in European flounders (Platicthys flesus) subjected to estuarine pollution [J]. Mar. Environ. Res., 2004,58:571-575.

    [26] Vasconcelos M H, Tam S C, Beattie J H, et al. Evidence for differences in the post-transcriptional regulation of rat metallothionein isoforms [J]. Biochem. J., 1996,315:665-671.

    [27] Kawata T, Nakamura S, Nakayama A, et al. An improved diagnostic method for chronic hepatic disorder: analysis of metallothionein isoforms and trace metals in the liver of patients with hepatocellular carcinoma and determined by capillary zone electrophoresis and inductively coupled plasma-mass spectrometry [J]. Biol. Pharm. Bull., 2006,29:403-409.

    [28] Zafarullah M, Olsson P E, Gedamu L.Differential regulation of metallothionein genes in rainbow trout fibroblasts, RTG-2 [J]. Biochem Biophys Acta, 1990,1049:318-323.

    [29] Hamza-Chaffai A, Amiard J C, Pellerin J, et al. The potential use of metallothionein in the clam Ruditapes decussatus as a biomarker of in situ metal exposure [J]. Comp. Biochem. Physiol., 2000,127:185-197.

    [30] Roch M, McCarter J A, Matheson M, et al. Hepatic Metallothionein in Rainbow Trout (Salmo gairdneri) as an Indicator of Metal Pollution in the Campbell River System [J]. Can. J. Fish. Aquat. Sci., 1982,39:1596-1601.

    [31] Wong C K, Yeung H Y, Cheung R Y, et al. Ecotoxicological assessment of persistent organic and heavy metal contamination in Hong Kong coastal sediment [J]. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 2000,38:486-493.

    [32] 毛天宇,戴明新,彭士濤,等.近 10年渤海灣重金屬(Cu, Zn, Pb, Cd, Hg)污染時(shí)空變化趨勢(shì)分析 [J]. 天津大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 42(9):817-825.

    [33] Hogstrand C, Haux C. Binding and detoxification of heavy metals in lower vertebrates with reference to metallothionein [J]. Comp. Biochem. Physiol., 1911,100:137-141.

    [34] Hermesz E, ábrahám M, Nemcsók J. Tissue-specific expression of two metallothionein genes in common carp during cadmium exposure and temperature shock [J]. Biochem. Physiol. Part C, 2001,128: 457-465.

    [35] Chan P, Shiu C, Wong F, et al. Common carp metallothionein gene: cDNA cloning, gene structure and expression studies [J]. Biochim. Biophys. Acta, 2004,1676:162-171.

    [36] Wu S M, Jong K J, Lee Y J. Relationships among metallothionein, cadmium accumulation, and cadmium tolerance in three species of fish [J]. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 2006,76:595-600.

    [37] Olsson P E, Larsson A, Mage A, et al. Induction of metallothionein synthesis in rainbow trout, Salmo gairdneri, during long-term exposure to water-borne cadmium [J]. Fish. Physiol. Biochem., 1989,6:221-229.

    [38] Cheung A P L, Lam T H-J, Chan K M. Regulation of Tilapia metallothionein gene expression by heavy metal ions [J]. Marine Environmental Research, 2004,58:389-394.

    Metallothionein mRNA expression in wild redeye mullet (Liza Haematocheila) for monitoring marine heavy metal pollution.

    AN Li-hui*, ZHENG Bing-hui, FU Qing, ZHAO Xing-ru, SHANG Jing-jing, ZHANG Lei (State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment, State Environmental Protection Key Laboratory of Estuarine and Coastal Research, Chinese Research Academy for Environment Sciences, Beijing 100012, China). China Environmental Science, 2011,31(8):1383~1389

    In this study, a 132-bp sequence corresponding to a 44-amino acid sequence of metallothionein gene was obtained, and then a quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay was developed for quantification of MT mRNA normalized to β-actin in redeye mullets. The method was applied to detect MT mRNA expression in redeye mullets from Nandaihe and Dashentang in Bohai Bay, and the results showed that MT mRNA expression in redeye mullets was higher significantly from Nandaihe (0.012 ± 0.0064 copies/copy β-actin in males and 0.0099 ± 0.0042 copies/copy β-actin in females) than that from Dashentang (0.0017 ± 0.0011 copies/copy β-actin in males and 0.0014 ± 0.00095 copies/copy β-actin in females) which was consistent with the heavy metals concentrations, indicating that MT mRNA can be a promising biomarker for monitoring metals pollutions in coastal environment.

    redeye mullet (Liza Haematocheila);metallothionein mRNA;quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction;heavy metal

    X174

    A

    1000-6923(2011)08-1383-07

    2010-11-17

    國(guó)家“973”項(xiàng)目(2007CB407306);水體污染控制與治理技術(shù)重大專項(xiàng) (2009ZX07528-03);中國(guó)新型環(huán)境問(wèn)題(2009467109)

    * 責(zé)任作者, 副研究員, anlh@craes.org.cn

    安立會(huì)(1975-),男,河北廊坊人,副研究員,博士,主要從事環(huán)境有害污染物的生物毒理效應(yīng)和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)研究.發(fā)表論文20余篇.

    猜你喜歡
    梭魚(yú)定量重金屬
    梭魚(yú)級(jí)核潛艇
    春吃開(kāi)冰梭
    走向世界(2022年12期)2022-05-05 17:34:59
    梭魚(yú)TLR18基因克隆及表達(dá)分析
    顯微定量法鑒別林下山參和園參
    重金屬對(duì)膨潤(rùn)土膨脹性的影響
    當(dāng)歸和歐當(dāng)歸的定性與定量鑒別
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:25:44
    測(cè)定不同產(chǎn)地寬筋藤中5種重金屬
    中成藥(2018年8期)2018-08-29 01:28:16
    10 種中藥制劑中柴胡的定量測(cè)定
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    ICP-AES、ICP-MS測(cè)定水中重金屬的對(duì)比研究
    再生水回灌中DOM對(duì)重金屬遷移與保留問(wèn)題研究
    999久久久国产精品视频| 最新在线观看一区二区三区| 久久国产精品大桥未久av| 久久狼人影院| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久精品国产a三级三级三级| 国产精品免费视频内射| 无限看片的www在线观看| 看免费av毛片| 亚洲av男天堂| tocl精华| 成年人黄色毛片网站| 男女边摸边吃奶| 精品免费久久久久久久清纯 | 久久香蕉激情| 最近中文字幕2019免费版| 美女高潮到喷水免费观看| 热99久久久久精品小说推荐| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 蜜桃国产av成人99| 久久久久网色| 高清欧美精品videossex| 丝袜美足系列| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 高清在线国产一区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久这里只有精品19| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲精品自拍成人| av网站免费在线观看视频| 永久免费av网站大全| 精品免费久久久久久久清纯 | 亚洲一区中文字幕在线| 精品国产国语对白av| 亚洲国产中文字幕在线视频| 精品久久久久久电影网| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产色视频综合| 亚洲美女黄色视频免费看| 又大又爽又粗| 欧美在线一区亚洲| 捣出白浆h1v1| 一二三四社区在线视频社区8| 久热这里只有精品99| 国产日韩欧美在线精品| 十八禁高潮呻吟视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲精品成人av观看孕妇| 丝袜脚勾引网站| 91九色精品人成在线观看| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 咕卡用的链子| 欧美人与性动交α欧美软件| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产片内射在线| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久这里只有精品19| 99热国产这里只有精品6| 国产精品一区二区在线观看99| avwww免费| 久久久精品免费免费高清| 精品国产一区二区三区四区第35| 91成人精品电影| 午夜福利视频在线观看免费| 丁香六月天网| 嫩草影视91久久| 久久精品国产a三级三级三级| 男人舔女人的私密视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲av成人一区二区三| 正在播放国产对白刺激| 大香蕉久久成人网| 18在线观看网站| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲国产欧美一区二区综合| 男女边摸边吃奶| 欧美成狂野欧美在线观看| 一级片免费观看大全| 国产黄色免费在线视频| 黄片大片在线免费观看| 人妻人人澡人人爽人人| 国产激情久久老熟女| 国产成人啪精品午夜网站| 欧美一级毛片孕妇| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产一区二区在线观看av| 日本vs欧美在线观看视频| 国产97色在线日韩免费| 美女主播在线视频| 中文欧美无线码| 午夜老司机福利片| 两人在一起打扑克的视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲国产av影院在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 操出白浆在线播放| 女警被强在线播放| 桃红色精品国产亚洲av| 久久精品成人免费网站| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产欧美日韩一区二区精品| 日本av免费视频播放| 91国产中文字幕| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产成人av教育| 女警被强在线播放| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 99热国产这里只有精品6| 日韩制服骚丝袜av| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 黑人猛操日本美女一级片| 黑人猛操日本美女一级片| 高清在线国产一区| 精品第一国产精品| 午夜免费鲁丝| 黄色毛片三级朝国网站| 国产成人免费无遮挡视频| 黑人操中国人逼视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 五月天丁香电影| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲一区中文字幕在线| 国产成人欧美| av线在线观看网站| 成人国产一区最新在线观看| 国产在线一区二区三区精| 久久人人97超碰香蕉20202| 十八禁高潮呻吟视频| 天天影视国产精品| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲av美国av| 女人久久www免费人成看片| 久久精品国产亚洲av高清一级| 18在线观看网站| 久久这里只有精品19| 91麻豆av在线| 欧美另类一区| 精品一区二区三区av网在线观看 | 日韩视频一区二区在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产成人影院久久av| 免费高清在线观看视频在线观看| 男人添女人高潮全过程视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久国产精品影院| 美国免费a级毛片| 大型av网站在线播放| 久久精品国产亚洲av高清一级| 香蕉丝袜av| 黄频高清免费视频| 丝袜美腿诱惑在线| 51午夜福利影视在线观看| 久久久久国内视频| 成人手机av| 欧美日韩视频精品一区| 最黄视频免费看| 免费在线观看黄色视频的| 成人国语在线视频| 国产精品欧美亚洲77777| 成人国产av品久久久| 日本欧美视频一区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产一区二区 视频在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品第一国产精品| 又黄又粗又硬又大视频| 97人妻天天添夜夜摸| 久久久久久久国产电影| 涩涩av久久男人的天堂| 啦啦啦啦在线视频资源| 91字幕亚洲| 亚洲国产看品久久| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产在线视频一区二区| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 黄片大片在线免费观看| 久久九九热精品免费| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 两个人看的免费小视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| av不卡在线播放| 天堂俺去俺来也www色官网| av线在线观看网站| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久精品人人爽人人爽视色| 人成视频在线观看免费观看| 99精品久久久久人妻精品| 老司机福利观看| 国产成人a∨麻豆精品| 老司机深夜福利视频在线观看 | 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产高清视频在线播放一区 | 免费不卡黄色视频| 精品一区在线观看国产| 午夜福利视频精品| 狂野欧美激情性bbbbbb| 老汉色∧v一级毛片| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲久久久国产精品| 51午夜福利影视在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 中文字幕色久视频| 一级毛片精品| a级毛片黄视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 一个人免费在线观看的高清视频 | 国产精品亚洲av一区麻豆| 午夜免费鲁丝| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 超碰97精品在线观看| 国产在线观看jvid| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 亚洲熟女毛片儿| 涩涩av久久男人的天堂| 午夜福利,免费看| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久久久国内视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 一级毛片精品| 久久久久国产精品人妻一区二区| 波多野结衣av一区二区av| 午夜福利免费观看在线| 久久精品亚洲av国产电影网| 亚洲综合色网址| 美女福利国产在线| 麻豆乱淫一区二区| 日本欧美视频一区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 免费高清在线观看视频在线观看| 视频区图区小说| 国产片内射在线| 久久久久网色| av线在线观看网站| 在线天堂中文资源库| 嫁个100分男人电影在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 啦啦啦在线免费观看视频4| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产又爽黄色视频| 久久女婷五月综合色啪小说| 男人操女人黄网站| √禁漫天堂资源中文www| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲视频免费观看视频| 国产成人精品无人区| 国产成人欧美在线观看 | 搡老岳熟女国产| 99精品欧美一区二区三区四区| 69av精品久久久久久 | 精品一区二区三区四区五区乱码| 两个人看的免费小视频| 欧美精品亚洲一区二区| 99国产极品粉嫩在线观看| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲精品自拍成人| 国产精品 欧美亚洲| av不卡在线播放| 日本五十路高清| 国产一区二区激情短视频 | 国产精品一二三区在线看| 考比视频在线观看| 国产成人精品久久二区二区91| 99香蕉大伊视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 日韩 亚洲 欧美在线| 美女午夜性视频免费| 叶爱在线成人免费视频播放| 99久久精品国产亚洲精品| 在线观看免费高清a一片| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美日本中文国产一区发布| av不卡在线播放| 日本欧美视频一区| 日本a在线网址| 国产97色在线日韩免费| 国产亚洲精品一区二区www | av片东京热男人的天堂| 精品少妇内射三级| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 黄色视频不卡| 在线观看免费午夜福利视频| 午夜免费鲁丝| 一区二区三区激情视频| 宅男免费午夜| 欧美日韩视频精品一区| 黄色a级毛片大全视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 免费少妇av软件| cao死你这个sao货| 欧美另类亚洲清纯唯美| www日本在线高清视频| 男女午夜视频在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 中文字幕制服av| 日本精品一区二区三区蜜桃| 1024视频免费在线观看| 一级毛片电影观看| 亚洲专区国产一区二区| 宅男免费午夜| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲精品久久午夜乱码| 成年av动漫网址| 午夜福利免费观看在线| 亚洲伊人久久精品综合| 精品少妇内射三级| 精品人妻1区二区| 国产亚洲精品久久久久5区| 首页视频小说图片口味搜索| 精品久久久精品久久久| 成人国产一区最新在线观看| 免费高清在线观看日韩| 女人久久www免费人成看片| 天天影视国产精品| 国产伦人伦偷精品视频| 国产麻豆69| 一本久久精品| 亚洲欧美色中文字幕在线| av网站免费在线观看视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 男人爽女人下面视频在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 亚洲国产精品成人久久小说| 日韩视频在线欧美| 久久久久久久久久久久大奶| 欧美国产精品一级二级三级| 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美黑人精品巨大| 亚洲一区二区三区欧美精品| 青春草亚洲视频在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 热99久久久久精品小说推荐| 黄片大片在线免费观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲国产欧美在线一区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 99re6热这里在线精品视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 真人做人爱边吃奶动态| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产精品av久久久久免费| 久久久久视频综合| a级毛片黄视频| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲av国产av综合av卡| av天堂久久9| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产亚洲精品久久久久5区| 午夜久久久在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 久久中文看片网| bbb黄色大片| 午夜福利视频精品| 少妇精品久久久久久久| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产精品 欧美亚洲| 美女国产高潮福利片在线看| 国产精品久久久人人做人人爽| 嫁个100分男人电影在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲第一av免费看| 十八禁人妻一区二区| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 999精品在线视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 久久精品成人免费网站| 两个人看的免费小视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 在线看a的网站| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 国产成人免费无遮挡视频| 国产日韩欧美在线精品| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 热re99久久国产66热| 久久久精品免费免费高清| 免费观看a级毛片全部| 精品国产国语对白av| 天天影视国产精品| 久久久久久久国产电影| 狠狠狠狠99中文字幕| av天堂久久9| 午夜免费成人在线视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 正在播放国产对白刺激| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产成人精品无人区| 精品一区二区三区av网在线观看 | 欧美日韩av久久| 在线天堂中文资源库| 欧美黄色淫秽网站| 国产亚洲av高清不卡| 女人久久www免费人成看片| 2018国产大陆天天弄谢| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产精品一区二区在线观看99| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 999久久久国产精品视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 日本av手机在线免费观看| 国产日韩欧美亚洲二区| av超薄肉色丝袜交足视频| 黄色毛片三级朝国网站| 日本五十路高清| 精品福利永久在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲国产欧美一区二区综合| 免费av中文字幕在线| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久久国产精品麻豆| 亚洲精品乱久久久久久| 欧美成人午夜精品| 女性生殖器流出的白浆| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美变态另类bdsm刘玥| 一区在线观看完整版| 91九色精品人成在线观看| 午夜福利一区二区在线看| 中文字幕人妻熟女乱码| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 中文字幕精品免费在线观看视频| 欧美黑人精品巨大| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲精品国产av成人精品| 他把我摸到了高潮在线观看 | 精品熟女少妇八av免费久了| 成年人午夜在线观看视频| 免费在线观看完整版高清| 三级毛片av免费| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 69av精品久久久久久 | 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日韩视频在线欧美| 69精品国产乱码久久久| 97人妻天天添夜夜摸| 黄色视频不卡| 久久久国产一区二区| 欧美日韩黄片免| 国产成人精品无人区| 中文字幕高清在线视频| 国产免费av片在线观看野外av| 国产成人av教育| 青春草亚洲视频在线观看| 一区二区三区乱码不卡18| 国产一区二区三区综合在线观看| 首页视频小说图片口味搜索| 国产精品久久久久久精品古装| 美女大奶头黄色视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 午夜福利,免费看| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲成人免费av在线播放| 波多野结衣一区麻豆| 一二三四在线观看免费中文在| 国产成人精品在线电影| 国产一区二区 视频在线| 日本欧美视频一区| 日本wwww免费看| 蜜桃国产av成人99| 亚洲七黄色美女视频| 热re99久久国产66热| 99精品欧美一区二区三区四区| 午夜成年电影在线免费观看| 好男人电影高清在线观看| 大香蕉久久成人网| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 午夜福利在线免费观看网站| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 搡老岳熟女国产| 免费在线观看黄色视频的| 国产精品免费视频内射| 久久精品人人爽人人爽视色| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 日韩制服骚丝袜av| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产精品.久久久| 亚洲国产精品一区三区| 少妇精品久久久久久久| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产日韩欧美视频二区| 满18在线观看网站| 在线观看免费高清a一片| www.999成人在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 波多野结衣av一区二区av| 国产国语露脸激情在线看| 国产精品免费视频内射| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 一级毛片精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 成人影院久久| 免费少妇av软件| 日本av免费视频播放| 色婷婷久久久亚洲欧美| 青春草视频在线免费观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 黄色a级毛片大全视频| 我要看黄色一级片免费的| 在线永久观看黄色视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲欧美激情在线| 久久中文字幕一级| 91精品伊人久久大香线蕉| 宅男免费午夜| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产在线免费精品| 欧美精品一区二区大全| 亚洲av成人一区二区三| 日韩精品免费视频一区二区三区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 老司机影院成人| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲精品国产色婷婷电影| 嫩草影视91久久| 国产成人精品久久二区二区91| 一区二区三区乱码不卡18| 热99久久久久精品小说推荐| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲精品在线美女| 一级,二级,三级黄色视频| 黄色毛片三级朝国网站| 在线永久观看黄色视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 好男人电影高清在线观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 99国产精品一区二区三区| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲国产精品一区三区| 精品亚洲成国产av| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 男女边摸边吃奶| 精品国产国语对白av| 久久精品人人爽人人爽视色| 久久国产精品人妻蜜桃| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲伊人久久精品综合| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 永久免费av网站大全| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | h视频一区二区三区| 免费在线观看黄色视频的| 纯流量卡能插随身wifi吗| av超薄肉色丝袜交足视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 91成年电影在线观看| 国产1区2区3区精品| 欧美午夜高清在线| 精品一区在线观看国产| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲免费av在线视频| 我要看黄色一级片免费的| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 一级毛片女人18水好多| 午夜免费观看性视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 自线自在国产av| 日韩有码中文字幕| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲一区二区三区欧美精品| 咕卡用的链子| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲国产精品一区三区| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久精品国产a三级三级三级| 中亚洲国语对白在线视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲熟女精品中文字幕| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲天堂av无毛| 精品少妇内射三级| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久综合国产亚洲精品| www.av在线官网国产| svipshipincom国产片| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲,欧美精品.| 脱女人内裤的视频| 国产伦理片在线播放av一区| 黄色怎么调成土黄色| 久久久国产欧美日韩av| 大片电影免费在线观看免费| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 久久国产精品男人的天堂亚洲| a在线观看视频网站| 国产精品一二三区在线看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 激情视频va一区二区三区| 亚洲国产日韩一区二区| 真人做人爱边吃奶动态| 久久中文字幕一级| 国产成人精品久久二区二区免费| 最近中文字幕2019免费版| 精品高清国产在线一区| 久久人妻熟女aⅴ| 丝袜脚勾引网站| 纵有疾风起免费观看全集完整版|